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番茄SlDP1基因的克隆及功能研究

作　者: 杜利欣
导　师: 陈国平
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: SlDP1 基因沉默信息学分析表达分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

细胞周期是一个精密的过程，受到多种物质的调控，E2F/DP是其一个重要的功能复合体。DP是E2F的伴侣蛋白，使E2F异源二聚化，并协助其定位到细胞核，使基因转录或抑制。植物E2F/DP家族基因转录的总体水平较低，但是该家族基因在某些特异的组织中表达丰沛，如增生器官和生长旺盛的组织等。基因芯片分析发现该家族可能还参与植物生命过程的营养调控。本研究根据SNG数据库获得DNA序列信息克隆了番茄SlDP1基因，开放阅读框为906bp，可编码301个氨基酸。采用生物信息学的方法分析该基因及编码蛋白的分子特征；通过荧光定量PCR研究该基因的表达模式；研究SlDP1基因对激素、盐胁迫及伤害的应答特征；构建了沉默载体并对番茄进行遗传转化，检测该基因在番茄叶片的沉默效果。本研究得到的主要结论如下：①根据SNG数据库登录信息（SGN-U567182），设计引物克隆该基因的开放阅读框和部分C-末端序列，大小为1094bp，命名为SlDP1；②生物信息学分析，SlDP1基因定位于细胞核，具有保守的DNA结合域、二聚化区域和C-末端及多个磷酸化位点。二级结构预测SlDP1蛋白含51.50%的环状结构，34.55%的α螺旋和2.66%的β折叠。通过编码蛋白序列比对，显示该基因与葡萄等同源性高达70%~80%，同源区域主要集中在DNA结合域、二聚化区域和C-末端部分区域；③表达模式分析发现SlDP1基因在野生型番茄根、花及萼片以及果实成熟时期B、B+4及B+7时期表达量较高，并且在果实的发育成熟过程中其表达量有一个明显的上升趋势；④外源激素处理番茄植株发现，ACC和IAA处理的植株SlDP1基因表达量提高；⑤盐处理的叶片SlDP1基因表达量下降，伤害处理的叶片该基因表达量显著下降；⑥成功构建了pBIN19：SlDP1沉默载体，用接合转移的方法转化农杆菌LBA4404，通过番茄外植体侵染，Kan筛选获得转基因番茄苗。NPTII检测，将转基因苗命名为1-5五个株系；荧光定量PCR检测，叶片中SlDP1基因的沉默效果为约88%。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-9
1 绪论  9-16
  1.1 番茄概论  9
  1.2 细胞周期简介  9-10
  1.3 E2F/ DP 家族转录因子的生物学特性  10-13
    1.3.1 E2F 基因  10-11
    1.3.2 DP 基因  11
    1.3.3 E2F 和 DP 基因参与细胞周期调控  11-12
    1.3.4 植物 E2F/DP 家族基因生物学功能简介  12-13
  1.4 研究的目的与意义  13-14
  1.5 研究内容与技术路线  14-15
    1.5.1 研究内容  14
    1.5.2 技术路线  14-15
  1.6 本文的创新之处  15-16
2 番茄 SlDP1 基因的生物信息学分析  16-18
  2.1 软件及方法  16
  2.2 结果与分析  16-18
    2.2.1 SlDP1 核苷酸及编码蛋白质的理化分析  16
    2.2.2 SlDP1 蛋白二级结构预测及同源程度分析  16-18
3 番茄 SlDP1 基因的表达模式  18-23
  3.1 试验材料  18
    3.1.1 主要实验试剂  18
    3.1.2 植物材料  18
    3.1.3 主要仪器  18
  3.2 试验方法  18-21
    3.2.1 番茄各组织总 RNA 的提取及检测  18-19
    3.2.2 反转录 cDNA 的方法  19-20
    3.2.3 定量 PCR 研究 SlDP1 基因的表达模式  20-21
  3.3 结果与分析  21-23
    3.3.1 SlDP1 基因在野生型番茄组织的表达模式定量 PCR  21-22
    3.3.2 SlDP1 基因在野生型 WT、突变体 rin 及 Nr 组织的表达量比较  22-23
4 番茄 SlDP1 基因表达特性分析  23-27
  4.1 材料与仪器  23-24
    4.1.1 植物材料  23
    4.1.2 试剂与激素  23-24
    4.1.3 主要仪器  24
  4.2 实验方法  24-25
    4.2.1 样品的激素处理方法  24
    4.2.2 番茄幼苗的胁迫处理方法  24-25
    4.2.3 定量 PCR 研究激素及胁迫处理番茄 SlDP1 基因的表达  25
  4.3 实验结果  25-27
    4.3.1 激素处理对番茄 SlDP1 基因的影响定量 PCR  25-26
    4.3.2 盐胁迫和伤害胁迫对番茄 SlDP1 基因的影响  26-27
5 pBIN19-SlDP1 沉默载体的构建及转化番茄的研究  27-48
  5.1 实验材料与主要仪器  27-30
    5.1.1 菌株及载体  27
    5.1.2 植物材料及引物  27
    5.1.3 试剂、酶、抗生素及激素  27
    5.1.4 主要仪器设备  27-28
    5.1.5 培养基及试剂的配制  28-30
  5.2 实验方法  30-40
    5.2.1 制备大肠杆菌感受态细胞  30
    5.2.2 SlDP1 基因全长的克隆及鉴定  30-32
    5.2.3 SlDP1 基因片段的克隆及沉默载体的构建  32-37
    5.2.4 番茄的转化及转基因鉴定  37-40
  5.3 结果与分析  40-48
    5.3.1 SlDP1 基因开放阅读框及部分 3-末端序列的克隆及鉴定  40-42
    5.3.2 番茄沉默表达载体的构建及鉴定  42-45
    5.3.3 番茄的遗传转化  45-46
    5.3.4 转基因番茄 NPTII 基因检测  46-47
    5.3.5 转基因番茄沉默效果鉴定  47-48
6 讨论  48-50
7 结论与展望  50-52
  7.1 主要结论  50
  7.2 后续工作及展望  50-52
致谢  52-53
参考文献  53-57
附录  57

番茄SlDP1基因的克隆及功能研究

内容摘要

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