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重组腺病毒介导BMP-2/bFGF体外诱导山羊BMSC成骨分化的研究

作　者: 徐绘华
导　师: 郭奇峰
学　校: 广州医学院
专　业: 外科学
关键词: 腺病毒 骨形态发生蛋白2 碱性成纤维细胞生长因子 T2A 序列 山羊骨髓间充质干细胞
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景:骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs）作为组织工程骨最理想的种子细胞已无争议。在骨损伤的修复中,有多种细胞因子参与,如属于转化生长因子（TGF-β）超家族的骨形态发生蛋白2（BMP-2）是目前诱导成骨作用最确切的成员;另外,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种广谱的有丝分裂源,能够促进软骨及骨组织的形成,还可直接刺激血管形成以提高植入体内的组织工程骨的新骨形成,它还可与BMP-2共同诱导骨的发生,在骨愈合过程中也发挥重要作用。越来越多的研究发现BMP-2与bFGF联合诱导BMSC比单独应用BMP2或bFGF成骨活性更强。但外源性成骨诱导因子在直接植入体内时易被蛋白酶分解而失去活性、易被冲散流失和稀释,持续作用时间短、效价低,不能针对局部持续发挥刺激和成骨诱导作用。因此,选择基因治疗的方法,通过转基因诱导成骨可很好地克服直接应用外源性生长因子的不足,可增加生长因子的作用时间。腺病毒是目前应用最广的能高效将目的基因导入细胞的媒介之一,它是一种非致病性复制缺陷型载体,能提供长期的基因表达能力且免疫源性非常低,其宿主范围广,可感染人、鼠等多种属,具有广泛的组织亲和性,感染宿主后以附加体形式存在,其基因并不整合到宿主细胞基因组中,无插入突变激活癌基因的危险,且外源基因能游离地表达,持续表达数周或数月后消失,避免了目的基因持续过度表达引起的骨质增生,符合骨修复基因治疗的要求。本研究主要针对BMP-2与bFGF双基因共表达重组腺病毒载体的构建与鉴定、重组腺病毒介导BMP-2/bFGF体外诱导山羊BMSCs成骨分化等方面进行研究,本实验结果将为后续的骨质疏松基因治疗研究奠定前期的实验基础。目的:1、构建含目的基因BMP-2和bFGF的腺病毒真核细胞表达载体并对其进行鉴定。2、探讨腺病毒介导骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）双基因体外转染山羊骨髓间充质干细胞（BMSC）后目的基因表达与诱导成骨情况。方法:1、从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端,通过T2A Peptide的互补,延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的BglII酶切位点和下游引物的EcoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量OD260,计算病毒感染滴度。2、无菌条件下从山羊髂骨处骨穿收集肝素抗凝骨髓,采用密度梯度离心和贴壁法分离培养出骨髓间充质干细胞。取第2代细胞以Ad-GFP腺病毒(滴度1.9×1012VP/ml)MOI（multiplicity of infection）值:0、1000、2000、3000、5000、7000、9000、11000转染干细胞; 48h后荧光镜下观察转染情况,选择最佳MOI值转染2代干细胞,MTT法绘制Ad-GFP腺病毒组、Ad-BMP2-bFGF-GFP重组腺病毒组（滴度3.6×1011VP/ml）、未转染组细胞增殖曲线。另取第2代BMSCs随机分成2组在最佳MOI值下转染Ad-BMP2 -bFGF-GFP组;未转染组,每2d取细胞上清液于-80°冻存。18d后全部细胞予碱性磷酸酶（ALP）活性染色试剂盒染色。22d时收集全部细胞上清,hBMP-2 ELISA kit、h-bFGF ELISA kit试剂盒检测每组BMP-2、bFGF表达情况。结果:1、克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确,经BglⅡ和EcoRⅤ双酶切得到的BMP2-bFGF双基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中,转染293A细胞两周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为:3.6×1011VP/ml。2、Ad-GFP组MOI=5000时倒置显微镜下对比观察转染率约83%,细胞增殖曲线显示Ad-GFP、Ad-BMP2-bFGF-GFP对BMSCs生长无明显影响。Ad-BMP2-bFGF-GFP组转染BMSCs后,细胞形态由梭形逐渐向多角性、立方形转化,呈现明显的成骨改变。ALP活性染色试剂盒细胞染色出现成骨的特征性改变,Ad-GFP组及未转染组（-）。转染48 h后,与未转染组比较,Ad-BMP2-bFGF-GFP组经ELISA检测, BMP-2、bFGF已有显著表达（t = 30.313,P< 0.01、t=49.977,P< 0.01）,至第6d左右达到高峰,此后随着时间的推移两个蛋白的表达逐渐下降,但仍保持在一个可检测水平范围并持续20d左右。结论:1、经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功,为进一步转染骨髓间充质干细胞使其向成骨细胞分化奠定了基础。2、经Ad-BMP2-bFGF-GFP转染的BMSCs具有持续高水平目的蛋白表达活性,未出现明显单个基因优势表达的情况,转染后的BMSCs表现出明显的成骨活性,为以后的骨质疏松基因治疗奠定了实验基础。

全文目录


缩略语表  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-12
第一部分 成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建  12-21
  1 实验材料  12-13
  2 实验方法  13-15
  3 实验结果  15-19
  4 讨论  19-21
第二部分 重组腺病毒介导BMP-2/bFGF 体外诱导山羊BMSC 成骨分化的研究  21-36
  1 实验材料  21-22
  2 实验方法  22-24
  3 结果  24-33
  4 讨论  33-36
小结  36-37
参考文献  37-42
综述  42-47
研究生期间发表论文情况  47-48
致谢  48-49

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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