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共表达siRNA-Stat3与GRIM-19质粒对甲状腺癌细胞的抑制效应及机理探讨

作　者: 任仲喜
导　师: 王贵民
学　校: 吉林大学
专　业: 外科学
关键词: siRNA-Stat3 GRIM19 甲状腺肿瘤 凋亡
分类号: R736.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 26次
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内容摘要


甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，虽然绝大多数甲状腺肿瘤可以通过手术、131I、抑制TSH治疗获得良好的效果，但是仍有15%左右的病人因低分化早期转移而失去治疗机会。其中髓样癌、未分化癌和鳞癌的预后则更差，且对放、化疗不敏感。另外，部分分化较好的肿瘤，因为首次手术治疗不规范而出现局部复发，再次手术的风险大大增加。因此，我们对于这类难治性甲状腺癌寻求新的治疗方法，以改善病人预后，提高生存期,非常有现实意义。STAT3是JAK-STAT信号转导途径中，Janus激酶的底物。该途径调节细胞的生长增殖，如果持续性激活，可导致细胞异常增殖与恶性转化。目前已在多种肿瘤组织中，证实有Stat3的持续高表达，应用RNAi技术沉默Stat3的表达后，发现有显著的抗肿瘤效应。GRIM-19是STAT3的特异性抑制蛋白，可与STAT3蛋白结合，抑制其转录激活功能，从而阻止细胞生长增殖、促其凋亡。在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，尤其是异常高表达的基因，为了寻求更好的治疗方案以加强疗效，我们采取了siRNA-Stat3联合GRIM-19的基因治疗方法。目的：本研究观察siRNA-Stat3联合GRIM-19共表达质粒（pGRIM-19-Si-Stat3）对人甲状腺癌细胞SW579的抑制效应，并探讨其作用机制。方法：本实验分为五个组，分别为脂质体对照组（mock组）、空白质粒对照组（psi-Scramble组）、psi-Stat3组、pGRIM-19组以及pGRIM-19-si-Stat3组（pGS组）。脂质体法将各组质粒转染人甲状腺癌SW579细胞。（1）转染48h后相差显微镜下观察各组癌细胞生长情况及形态特征；（2）采用半定量逆转录PCR检测各组癌细胞Stat3和GRIM-19表达水平；（3）Western blot法检测STAT3、GRIM-19及Stat3的下游靶基因Bcl-2与MMP9蛋白表达情况；（4）MTT法检测各组质粒对SW579细胞增殖活性的影响；（5）划痕实验及Transwell实验观察各组质粒对SW579细胞迁移和侵袭的作用。结果：（1）半定量RT-PCR与Western blot结果显示pGS组与其余四组相比，Stat3表达下降，GRIM-19基因表达升高；pGS组Bcl-2、MMP9的蛋白表达明显下降；（2）显微镜下，pSi-Stat3组、pGRIM-19组与两个对照组相比，呈病态改变，细胞皱缩、变圆，细胞稀疏，细胞周围可见颗粒样物；pGS组细胞改变更加明显，细胞稀少，并可见到细胞碎片。（3）MTT实验数据显示，pGS组SW579细胞增殖活性受到明显抑制，共表达质粒表现出良好的协同作用；（4）划痕实验及Transwell实验的结果提示pGS组SW579细胞相比于其他各组，迁移和侵袭性明显降低。结论：（1）共表达质粒pGS对SW579细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用，并降低了其侵袭与迁移能力，与单一的psi-Stat3或pGRIM-19比较，有明显的协同作用。（2）pGS治疗甲状腺癌的机制可能是一方面siRNA-Stat3抑制了Stat3的基因表达；另一方面增强表达的GRIM-19抑制了STAT3的转录激活功能。两方面协同作用于Stat3,导致其下游MMP9和Bcl-2的基因表达下降,从而最终抑制了细胞增殖、侵袭和迁移能力，导致细胞凋亡。

全文目录


前言  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-13
第1章 绪论  13-24
  1.1 癌基因 Stat3 与肿瘤的研究进展  13-21
    1.1.1 Stat3 的基本结构  13-14
    1.1.2 STAT3 活化机制  14
    1.1.3 Stat3 与 SOCS3  14
    1.1.4 Stat3 调控的靶基因  14-17
    1.1.5 Stat3 与甲状腺癌的研究进展  17-18
    1.1.6 RNAi 技术与肿瘤的研究进展  18-21
  1.2 GRIM-19 的研究进展  21-24
    1.2.1 肿瘤中 GRIM-19 基因突变与低表达  22
    1.2.2 GRIM-19 与 STAT3  22-24
第2章 材料与方法  24-31
  2.1 主要试剂及器材  24-25
    2.1.1 试剂  24
    2.1.2 主要仪器  24-25
    2.1.3 质粒与菌株  25
    2.1.4 细胞株  25
  2.2 实验方法  25-31
    2.2.1 质粒提取流程  25-26
    2.2.2 细胞培养  26
    2.2.3 细胞转染  26
    2.2.4 RT-PCR 检测基因表达水平  26-28
    2.2.5 Western blot 检测蛋白表达水平  28-29
    2.2.6 MTT 法检测肿瘤细胞增殖活性  29
    2.2.7 划痕试验检测肿瘤细胞转移能力  29-30
    2.2.8 肿瘤细胞侵袭实验  30
    2.2.9 统计学方法  30-31
第3章 实验结果  31-35
  3.1 各组质粒对 SW579 细胞形态及增殖的影响  31
  3.2 各组质粒对 SW579 细胞生长增殖能力的影响  31-32
  3.3 各组 SW579 细胞 STAT3、GRIM-19 mRNA 表达水平  32-33
  3.4 各组 SW579 细胞 STAT3、GRIM-19、 Bcl-2 及 MMP-9 的蛋白表达水平  33
  3.5 各组质粒对 SW579 细胞迁移能力的影响  33-34
  3.6 各组质粒对 SW579 细胞侵袭能力的影响  34-35
第4章 讨论  35-38
第5章 结论  38-39
参考文献  39-46
作者简介及在学期间所取得的科研成果  46-47
致谢  47

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 内分泌腺肿瘤 > 甲状腺肿瘤
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