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PTEN转染的内皮祖细胞靶向治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤的初步研究

作　者: 朱智
导　师: 易继林
学　校: 华中科技大学
专　业: 普外科
关键词: 内皮祖细胞骨髓细胞培养实验研究 DAPI 皮下移植瘤归巢基因治疗肝癌靶向治疗 PTEN EPCs
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部分内皮祖细胞的分离培养及生物学行为的实验研究目的：分析体外小鼠骨髓来源的内皮祖细胞的分离及培养方法,对比早期和晚期内皮祖细胞的生物学活性,以期为后续研究提供良好的实验基础。方法：通过密度梯度离心法分离出小鼠骨髓中的单个核细胞,种植于人纤维粘连蛋白包被的培养板上,在血管内皮生长因子和重组人上皮细胞生长因子刺激下生长,纯化早晚期内皮祖细胞。比较早晚期内皮祖细胞的细胞形态,FITC-UEA-I、 Dil-ac-LDL摄取率,流式检测常见细胞表面标记物的表达情况,MTT法检测两组细胞增殖情况的不同,Transwell法检测两组细胞的侵袭能力的差异,体外小管形成实验检测两组间形成新生血管能力的区别。结果：成功从小鼠骨髓中分离出早期和晚期内皮祖细胞,早期内皮祖细胞呈集落样生长,晚期呈铺路石样生长,早晚期内皮祖细胞均能摄取FITC-UEA-I、 Dil-ac-LDL且双阳性染色细胞无明显差异。晚期内皮祖细胞中VEGF-2(?)勺表达更高(p<0.05),而早期内皮祖细胞CD133表达更高(p<0.05)。晚期内皮祖细胞具有更强的增殖及形成新生血管的能力(p<0.05),早期内皮祖细胞则拥有更强的迁移能力(p<0.05)。结论：从小鼠骨髓中分离内皮祖细胞是一种优势明显且切实可行的方法,早晚期内皮祖细胞各自具有不同的生物学特性,关于内皮祖细胞的深入性实验可根据实验目的选择不同时期的内皮祖细胞,为进一步的实验提供理论基础。第二部分荧光标记的内皮祖细胞在裸鼠皮下移植瘤的归巢目的：了解通过荧光标记的内皮祖细胞在裸鼠皮下移植瘤及其他重要脏器中的分布情况。方法：利用肝癌细胞株HepG2细胞建立裸鼠肝癌皮下移植瘤,将4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)标记的内皮祖细胞通过尾静脉输注入小鼠体内,观察不同时期荧光标记的EPCs在裸鼠移植瘤及其他重要脏器内的分布情况,并通过RT-PCR检测CD133、HIF-1α、SDF-1及VEGF在输注后不同时间段肿瘤和各重要脏器内的表达情况。结果：携带DAPI荧光标记的内皮祖细胞在裸鼠肝癌皮下移植瘤中的分布明显高于其他重要脏器(p<0.05),在肝脏中的分布极少,CD133、HIF-1α、SDF-1及VEGF在肿瘤中的表达也明显高于其他脏器(p<0.05)。结论：内皮祖细胞对肝癌具有定向趋化作用,有成为肝癌靶向治疗载体的潜力。第三部分携带PTEN基因的内皮祖细胞对肝癌裸鼠皮下移植瘤靶向性抑制的初步研究目的：了解携带常见抑癌基因PTEN的内皮祖细胞对肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制及凋亡的情况,探索将EPCs作为肝癌靶向载体的可行性。方法：脂质体法将带有野生型PTEN基因的质粒转入EPCs和HUVEC,经尾静脉注入裸鼠体内,并将EPCs直接输注入裸鼠体内作为对照组,观察各组移植瘤体积、重量变化,计算抑瘤率。Western检测PTEN基因、凋亡蛋白Bad和抗凋亡蛋白Bcl-2在各组肿瘤中的表达,Tunel法检测肿瘤组织中的细胞凋亡率。结果：输注入gWT-PTEN/pGZ21δxZ的EPCs组(PTEN-EPCs组)的抑瘤率为56.85%,明显高于其他组(p<0.05);PTEN-EPCs组中PTEN和Bad蛋白的表达明显高于其他组,而Bcl-2蛋白的则明显低于其他组(p<0.05)；通过Tunel法检测发现PTEN-EPCs组的细胞凋亡率为19.42±4.12%,明显高于其他组(p<0.05)。结论：内皮祖细胞可以成为肝癌靶向治疗的载体,利用常见抑癌基因PTEN进行的基因治疗抑瘤效果明显,可以成为一种新的治疗肝癌的方法。

全文目录

前言  5-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
第一部分内皮祖细胞的分离培养及生物学行为的实验究  14-26
  实验材料  14-15
  研究方法  15-17
  结果  17-20
  讨论  20-23
  参考文献  23-26
第二部分荧光标记的内皮祖细胞在裸鼠皮下移植瘤及其他重要脏器中的分布  26-42
  实验材料  26-27
  试验方法  27-32
  结果  32-34
  讨论  34-38
  参考文献  38-42
第三部分携带PTEN基因的内皮祖细胞对肝癌裸鼠皮下移植瘤靶向性抑制的初步研究  42-56
  实验材料  42-43
  试验方法  43-46
  实验结果  46-50
  讨论  50-52
  参考文献  52-56
全文总结  56-57
综述一  57-71
  参考文献  63-71
综述二  71-79
  参考文献  74-79
附录  79-81
致谢  81-83
攻读学位期间发表的学术论文  83

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