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急性缺血性脑损伤后Apelin神经细胞保护作用的实验研究

作　者: 蔡世昌
导　师: 白波; 张秋玲
学　校: 泰山医学院
专　业: 神经生物学
关键词: Apelin 脑卒中 脑缺血再灌注 神经干细胞 细胞凋亡
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)法制备大鼠脑急性缺血再灌注模型，利用apelin-13进行超早期干预治疗，观察大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡发生率，caspase-3和caspase-12mRNA表达的变化和细胞内氧化应激的变化情况，检测新生神经细胞的数量；探讨apelin对急性缺血性脑中风的神经保护作用及其可能的作用机制。方法1．实验动物分组：取清洁级Wister成年雄性大鼠48只，随机分成四组，每组12只；分别为空白对照组（blank groupⅠ组）；假手术对照组（sham group，Ⅱ组）；缺血再灌注组（ischemia reperfusion group， I/R，Ⅲ组）；缺血再灌注+Apelin干预组(ischemia reperfusion with apelin group，I/R+A，Ⅳ组)。2．动物模型的制备：按0.3ml/100g体重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分离右侧颈总动脉（CCA）至颈总动脉分叉处，辨别并分离颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）；结扎ECA远端，夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端。用自制处理过的尼龙线从颈外动脉剪口处插入，经CCA进入ICA，以颈总动脉分叉处开始计算，进线深度为18.0±0.5mm，行至大脑中动脉起始部形成栓塞，造成局灶性脑缺血状态。缺血30min/2h缓慢拔出尼龙栓子按预设时间再灌注后取材。3．TTC染色：取各组手术成功大鼠行腹主动脉灌注TTC染色，取脑查看各组大鼠脑梗死范围和程度。4.Apelin-13侧脑室注射及给药剂量：取第Ⅳ组MCAO造模成功的大鼠，侧脑室内微量缓慢注射10μl apelin。5.Brdu掺入方法：大鼠腹腔注射Brdu（75mg/kg体重），每天早晚各一次，连续注射三天，最后一次注射完2h后取脑。6.石蜡切片， Brdu染色，免疫组化检查新生神经细胞的表达情况。7.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），观察各实验组大鼠损伤侧大脑皮层caspase-3mRNA，caspase-12mRNA，APJ表达的变化。8.细胞凋亡测定：利用Annexin Ⅴ和PI双染确定凋亡细胞，以流式细胞仪统计各组大鼠神经细胞凋亡数。9.大鼠脑缺血后氧化应激功能的检测：取大鼠脑组织匀浆液，测定MDA浓度，谷胱甘肽过氧化物酶浓度以及其总抗氧化能力。结果1.线栓法制备大鼠急性局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO），缺血2h/30min后再灌注；利用Zea-LongaⅤ级评分标准对动物模型进行评分，得分为2-3分的实验动物为模型制备合格动物，经TTC染色观察梗死灶明显，说明MCAO模型成熟稳定，可进行下一步实验。2.免疫组化检测结果显示：脑缺血再灌注后在大脑皮层、纹状体、侧脑室区、蛛网膜下腔和海马CA区都存在Brdu阳性表达的细胞；Apelin可明显增加缺血脑区新生细胞数量。3.RT-PCR检测发现：单纯急性脑缺血再灌注后caspase-3mRNA在大脑皮层表达显著升高，caspase-12mRNA的表达也明显升高；Apelin干预后caspase-12mRNA的表达明显下调，而caspase-3mRNA表达变化不明显。4.流式细胞仪测定：假手术组脑细胞凋亡率和空白组没有明显区别；单纯脑缺血再灌注3h后细胞凋亡率显著增高并持续增高，至脑缺血再灌注24h脑细胞凋亡率达到最高峰，手术后48h开始降低，Apelin组缺血侧脑区脑细胞凋亡率与对照组比较显示降低趋势，随再灌注时间延长，差别明显。5.氧化应激功能检测：大鼠急性脑缺血再灌注后能显著的降低谷胱甘肽过氧化物酶的活力，从而降低其总抗氧化能力，造成氧自由基损害明显，脂质氧化加剧，产生MDA明显增多。Apelin的干预明显提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，提高其抗氧化能力（与单纯缺血组比较P＜0.01）。结论本研究利用多种技术手段，从不同角度探讨apelin对神经细胞的再生、凋亡、及抗氧化能力的影响。实验表明：①A pelin干预可能通过抑制凋亡因子caspase-12mRNA的表达而抑制脑缺血后神经细胞内质网介导的细胞凋亡。②首次证实apelin能促进脑缺血再灌注后神经细胞的增殖，阻断细胞凋亡进程，起到神经保护作用。③Apelin超早期干预后能够提高神经细胞内总谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低脂质氧化作用从而有效的提高组织的总抗氧化能力以对抗急性脑缺血再灌注后神经细胞的氧化应激作用。本课题研究显示apelin-APJ系统在急性脑缺血再灌注损伤后具有神经保护功能。其可能的作用护机制与apelin通过PI3K/akt通路等多种途径发挥作用有关；实验证实，Apelin-13通过诱导ERK1/2的磷酸化[1]对抗N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）兴奋性毒性损伤，减少NMDA诱导的细胞内Ca2+的堆积造成的细胞毒性作用，对抗氧自由基对细胞膜的损害，从而起到内源性神经保护作用。本实验为进一步阐述apelin-APJ系统对减少神经细胞凋亡的作用及可能的作用机制提供了实验依据，为缺血性脑中风的临床治疗，减少中风病人死亡率和致残率提供新的思路，具有重要的理论意义和实际应用价值。

全文目录


中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
符号说明  10-11
前言  11-13
材料与方法  13-25
结果  25-37
讨论  37-43
结论  43-44
参考文献  44-49
综述  49-57
  参考文献  54-57
致谢  57-58
攻读学位期间发表的学术论文  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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