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梓醇和前B细胞克隆增强因子的神经保护作用

作　者: 毕静
导　师: 安利佳; 姜波
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 梓醇星形胶质细胞线粒体功能紊乱帕金森症(PD) 脑缺血前B细胞克隆增强因子(PBEF) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)
分类号: R742.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本研究以帕金森(PD)和脑缺血损伤模型为例,采用原代皮层纯星形胶质细胞培养体系、皮层或中脑纯神经元培养体系以及中脑神经元-星形胶质细胞混合培养体系作为研究对象,探讨梓醇和PBEF在神经退行性疾病中的保护作用和机理,主要内容如下：1.梓醇的神经保护作用梓醇在纯星形胶质细胞培养体系中的神经保护作用。一方面,采用H202诱导的星形胶质细胞氧化应激损伤,结果发现,梓醇能够明显提高细胞活力,减少细胞内ROS的形成。此外,梓醇还通过增强谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等谷胱甘肽代谢循环中关键酶的活性以及降低氧化型谷胱甘肽(GSSG)在总谷胱甘肽(GSx)中的比例,从而抑制H202诱导的氧化应激损伤。但是,梓醇对过氧化氢酶(CAT)活性的增强作用却并不明显,说明梓醇在此损伤模型中潜在的保护机制主要是增强谷胱甘肽代谢循环效率以及抑制ROS生成。另一方面,采用脂多糖(LPS)与干扰素-Y(IFN-Y)共同刺激星形胶质细胞诱导炎症反应,结果表明,梓醇显著抑制了一氧化氮(NO)和ROS的生成,削弱了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。此外,梓醇还明显下调了相关炎症基因iNOS、环氧化酶-2(COX-2)和Toll样受体-4(TLR4)的表达。进一步研究发现,梓醇的抗炎作用是通过调节核转录因子-kB(NF-KB)的激活以控制下游炎症因子的表达与释放,从而抑制星形胶质细胞激活诱发的炎症反应,最终实现神经保护的目的。梓醇在中脑纯神经元培养体系中的神经保护作用。利用鱼藤酮诱导中脑神经元损伤以模拟PD的发生,通过细胞形态学、免疫组化以及流式细胞分析,发现梓醇能够有效地抑制鱼藤酮诱导的中脑神经元凋亡或坏死。更进一步,发现梓醇是通过调控细胞外调节蛋白激酶(ERK)以抑制iNOS表达与NO释放,从而使神经元免于变性死亡的命运。梓醇在中脑神经元-星形胶质细胞混合培养体系中的神经保护作用。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)已经是众所周知的临床以及生化水平上的神经毒素,可以模拟PD的发生。其主要作用机理是：MPTP先被星形胶质细胞内的单胺氧化酶-B(MAO-B)转化成有毒性的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+),然后被神经元选择性吸收,并且损伤神经元的线粒体造成功能紊乱,而最终导致神经元变性死亡。本研究中,利用MPTP分别处理中脑神经元-星形胶质细胞混合培养体系,以进一步探索梓醇的神经保护作用及其潜在的保护机制。结果发现,梓醇预处理明显削弱了神经元变性死亡的趋势,其保护机制涉及对线粒体功能的改善,主要体现在：增强了线粒体复合物I活性,阻止了线粒体膜电位(MMP)的损失,抑制了ROS的产生与Ca2+超载以及降低了线粒体通透性转运孔(MPTp)的开放度。2. PBEF的神经保护作用前B细胞克隆增强因子(PBEF)是烟酰胺(NAM)转化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)过程中的限速酶,在NAD+生物合成补救途径过程中起到重要作用。最近以小鼠为对象的研究表明,PBEF主要在野生型(+／+)以及半敲除型(+／-)小鼠的神经元中表达。采用光栓法建造脑缺血模型,发现与PBEF+/+相比,PBEF+/-小鼠更容易受到损伤而导致更大的缺血面积。本研究以原代小鼠皮层神经元为实验对象,采用氧糖剥夺模型(OGD)以及谷氨酸神经兴奋性毒性体外模拟脑缺血缺氧损伤,继续探索PBEF在脑缺血缺氧损伤中的神经保护作用。结果表明,作为PBEF的底物与产物,NAM和NAD+在OGD以及谷氨酸诱导的神经损伤模型中表现出较好的神经保护作用。利用PBEF特异性抑制FK866展开进一步研究,发现FK866的处理会加剧OGD诱导的神经损伤,表现在降低的细胞活力和NAD+水平上；而且,在谷氨酸诱导的神经兴奋性毒性损伤中,野生型PBEF过表达的神经元表现出更强的生命力,提示作为NAD+合成的限速酶,PBEF在脑缺血缺氧损伤模型中扮演着至关重要的角色。通过对线粒体功能的检测与分析,发现外源NAD+与NAM的补充明显削弱了OGD与FK866引起的线粒体生物合成障碍。此外,野生型PBEF过表达的神经元能够在一定程度上抑制谷氨酸诱导的MMP损失,提示PBEF的神经保护作用一部分是通过对线粒体功能的调节和优化实现的。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
引言  13-14
1. 文献综述  14-38
  1.1 帕金森综合症概述  14-19
    1.1.1 PD的致病机制  14-16
    1.1.2 PD的预防与治疗措施  16-18
    1.1.3 PD模型的构建  18-19
  1.2 脑缺血缺氧损伤的概述  19-23
    1.2.1 脑缺血的致病机制  19-21
    1.2.2 脑缺血损伤模型的构建  21-23
  1.3 星形胶质细胞概述  23-29
    1.3.1 星形胶质细胞的特性  23-25
    1.3.2 星形胶质细胞的生物学功能  25-26
    1.3.3 星形胶质细胞与神经元之间的相互作用  26-28
    1.3.4 星形胶质细胞与神经元之间的谷氨酸-谷氨酰胺代谢偶联  28
    1.3.5 星形胶质细胞的激活与炎症反应  28-29
  1.4 NAD、NAM和PBEF的研究概况  29-33
    1.4.1 NAD的合成与代谢过程  29-31
    1.4.2 PBEF的生物学功能  31-33
  1.5 梓醇的研究概况  33-35
    1.5.1 梓醇的理化性质  33
    1.5.2 梓醇的药理活性  33-35
  1.6 选题依据  35-38
2. 梓醇在纯星形胶质细胞培养体系中的神经保护作用  38-63
  2.1 实验材料与设备  40-41
    2.1.1 实验动物  40
    2.1.2 主要试剂  40
    2.1.3 主要仪器  40-41
  2.2 实验方法  41-46
    2.2.1 小鼠皮层纯星形胶质细胞培养  41
    2.2.2 免疫细胞化学染色  41
    2.2.3 细胞活力测定  41-42
    2.2.4 ROS含量测定  42
    2.2.5 GSx与GSSG含量测定  42
    2.2.6 GR活性测定  42-43
    2.2.7 GSH-Px活性测定  43
    2.2.8 CAT活性测定  43
    2.2.9 NO含量和iNOS活性测定  43-44
    2.2.10 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)  44-46
    2.2.11 NF-KB表达的测定  46
    2.2.12 统计学分析方法  46
  2.3 实验结果  46-58
    2.3.1 梓醇对H202诱导的星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用  46-53
      2.3.1.1 星形胶质细胞的形态学观察  46-47
      2.3.1.2 H202最佳损伤浓度的筛选  47-48
      2.3.1.3 梓醇对H202诱导的星形胶质细胞损伤的保护作用  48-49
      2.3.1.4 梓醇对H202诱导的星形胶质细胞ROS生成的影响  49
      2.3.1.5 梓醇对星形胶质细胞GSx与GSSG含量的影响  49-50
      2.3.1.6 梓醇对星形胶质细胞GR、GSH-Px和CAT活性的影响  50-53
    2.3.2 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞激活的抑制作用  53-58
      2.3.2.1 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞激活的形态学影响  53-54
      2.3.2.2 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞NO生成和iNOS活性的影响  54-55
      2.3.2.3 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞ROS生成的影响  55
      2.3.2.4 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞炎症因子表达的影响  55-57
      2.3.2.5 梓醇对LPS+IFN-Y诱导的星形胶质细胞NF-KB活性的影响  57-58
  2.4 讨论  58-61
  2.5 小结  61-63
3. 梓醇在中脑纯神经元培养体系中的神经保护作用  63-74
  3.1 实验材料与设备  63-64
    3.1.1 实验动物  63
    3.1.2 主要试剂  63-64
    3.1.3 主要仪器  64
  3.2 实验方法  64-66
    3.2.1 小鼠中脑纯神经元的培养  64-65
    3.2.2 免疫细胞化学分析  65
    3.2.3 Hoechst 33258染色  65
    3.2.4 流式细胞仪分析凋亡与坏死  65-66
    3.2.5 NO含量测定  66
    3.2.6 免疫印记(Western Blotting)  66
    3.2.7 统计学分析方法  66
  3.3 实验结果  66-71
    3.3.1 梓醇对鱼藤酮诱导的中脑多巴胺能神经元损伤的保护作用  66-68
    3.3.2 梓醇对鱼藤酮诱导的中脑神经元凋亡与坏死的影响  68-69
    3.3.3 梓醇对鱼藤酮诱导的中脑神经元NO生成和iNOS表达的影响  69-70
    3.3.4 梓醇对鱼藤酮介导的JNK和ERK信号通路的调控  70-71
  3.4 讨论  71-73
  3.5 小结  73-74
4. 梓醇在中脑神经元-星形胶质细胞混合培养体系中的神经保护作用  74-85
  4.1 实验材料及设备  75-76
    4.1.1 实验动物  75
    4.1.2 主要试剂  75
    4.1.3 主要设备  75-76
  4.2 实验方法  76-79
    4.2.1 小鼠中脑神经元.星形胶质细胞混合培养  76
    4.2.2 细胞活力与LDH的测定  76
    4.2.3 细胞线粒体提取  76-77
    4.2.4 ROS含量测定  77
    4.2.5 线粒体膜电位(MMP)的测定  77
    4.2.6 线粒体复合物I活性测定  77
    4.2.7 线粒体通透性转运孔(MPTp)开放度的测定  77-78
    4.2.8 细胞内钙离子(Ca2+)测定  78
    4.2.9 统计学分析方法  78-79
  4.3 实验结果  79-82
    4.3.1 梓醇对MPP+诱导的中脑神经元损伤的的保护作用  79
    4.3.2 梓醇对MPP+诱导的线粒体功能紊乱的影响  79-80
    4.3.3 梓醇对MPP+诱导的ROS生成和Ca2+超载的影响  80-82
    4.3.4 梓醇对MPP+诱导的MPTp开放的影响  82
  4.4 讨论  82-84
  4.5 小结  84-85
5. PBEF在脑缺血缺氧损伤中的神经保护作用  85-109
  5.1 实验材料与设备  86-87
    5.1.1 实验动物  86
    5.1.2 主要试剂  86
    5.1.3 主要仪器  86-87
  5.2 实验方法  87-89
    5.2.1 原代皮层神经元的培养以及OGD模型的构建  87
    5.2.2 细胞的存活与死亡测定  87
    5.2.3 免疫细胞化学染色  87-88
    5.2.4 活细胞实时成像测定MMP  88
    5.2.5 细胞内NAD+含量测定  88
    5.2.6 细胞内ATP含量测定  88
    5.2.7 细胞转染  88-89
    5.2.8 线粒体生物合成的测定  89
    5.2.9 统计学分析方法  89
  5.3 实验结果  89-106
    5.3.1 外源NAD+与NAM对OGD及谷氨酸诱导的神经元损伤的保护作用  89-95
    5.3.2 外源NAD+与NAM对FK866引起的神经元损伤的保护作用  95-96
    5.3.3 FK866加剧OGD诱导的神经元损伤与NAD+耗竭  96-97
    5.3.4 PBEF通过调节NAD+合成削弱神经元损伤  97-101
    5.3.5 PBEF在正常或OGD损伤条件下对细胞ATP水平的影响  101-102
    5.3.6 PBEF在损伤条件下对线粒体生物合成的影响  102-104
    5.3.7 PBEF在谷氨酸兴奋性毒性损伤中对MMP的影响  104-106
  5.4 讨论  106-108
  5.5 小结  108-109
结论与展望  109-112
  结论  109-111
  展望  111-112
创新点  112-113
参考文献  113-125
附录缩略词表  125-128
攻读博士学位期间发表学术论文情况  128-129
致谢  129-130
作者简介  130-131

梓醇和前B细胞克隆增强因子的神经保护作用

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