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岩藻甾醇诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡作用及死亡受体途径研究

作　者: 宋冬雪
导　师: 俞仲毅
学　校: 哈尔滨商业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 岩藻甾醇 HL-60细胞 细胞凋亡 死亡受体
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本课题研究了岩藻甾醇对人早幼粒白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用,并初步探讨了它的作用机制和途径。MTT实验结果表明,岩藻甾醇对HL-60细胞的生长有抑制作用,并呈剂量依赖性,各剂量组的OD值与空白对照组比较均具有显著差异(P<0.01)。岩藻甾醇对HL-60细胞的IC50=34.40μmol-L-1。采用Hoechst33258染色,荧光倒置显微镜下观察岩藻甾醇作用后细胞形态变化。结果表明,空白对照组细胞界限清晰,细胞核呈现弥散均匀荧光；岩藻甾醇作用于HL-60细胞48h后,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光,随着给药浓度的增加,细胞出现凋亡小体并且逐渐增多。采用PI单染,在流式细胞仪下检测细胞周期分布和细胞的凋亡率。结果表明,岩藻甾醇作用于HL-60细胞24h后,细胞的凋亡率随着给药浓度的升高而增多,呈一定的剂量依赖性,浓度17.20μmol·L-1组凋亡率为15.64%,34.40μmol·L-1组凋亡率为16.80%,68.80μmol·L-1组凋亡率为17.15%,阳性药组凋亡率为22.04%。Go/G1期和S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高,并呈二定的剂量依赖性,表明岩藻甾醇使HL-60细胞周期阻滞于G2/M期。在以上实验基础上,我们考察了岩藻甾醇诱导HL-60细胞凋亡的途径。应用激光共聚焦扫描显微镜检测了岩藻甾醇作用24h后的HL-60细胞中Fas和FasL蛋白表达量。结果表明,岩藻甾醇作用24h后,Fas、FasL蛋白的表达量均有所升高,并呈一定的剂量依赖关系。实验结果提示岩藻甾醇有可能通过死亡受体途径中的Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。进一步应用激光共聚焦扫描显微镜法检测了岩藻甾醇作用后HL-60细胞中死亡受体相关蛋白Fadd,Caspase-8的表达量。结果表明,岩藻甾醇作用24h后,Fadd, Caspase-8蛋白的表达量均有所升高,并呈一定的剂量关系。在以上实验的基础上,还考察了与死亡受体途径相关的Caspase家族蛋白Caspase-8,Caspase-3的活性变化。用比色法检测凋亡相关酶的活性变化,结果表明,岩藻甾醇作用于HL-60细胞24h后,Caspase-8,Caspase-3的活性有显著变化,随着给药浓度的增加,活性不断增强,与阴性组对照具有统计学意义(P<0.01)。综上所述,岩藻甾醇具有体外抗肿瘤作用,并能诱导HL-60细胞凋亡。其作用机制可能是通过加强HL-60细胞死亡受体蛋白Fas,FasL的表达及死亡受体相关蛋白Fadd以及Caspase-8的表达；死亡受体蛋白Fas与FasL结合,再与死亡结构域蛋白Fadd结合,活化pro-Caspase-8,形成诱导死亡信号复合物,激活下游的效应Caspase-3,使细胞通过死亡受体途径凋亡。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
1 绪论  10-23
  1.1 甾醇的国内外研究现状  10-15
    1.1.1 甾醇概述  10
    1.1.2 动物甾醇  10
    1.1.3 植物甾醇  10-14
    1.1.4 菌类甾醇  14-15
    1.1.5 甾醇的应用  15
  1.2 白血病  15-18
    1.2.1 白血病概述  15-16
    1.2.2 白血病的特征  16
    1.2.3 血病的症状  16-17
    1.2.4 白血病的致病因素  17-18
  1.3 细胞凋亡  18-21
    1.3.1 细胞凋亡的概念及其形态学特点  18-19
    1.3.2 细胞凋亡与死亡受体  19-21
  1.4 本课题的来源及研究意义  21-22
    1.4.1 课题来源  21-22
    1.4.2 本课题研究的意义  22
  1.5 论文的研究内容  22-23
    1.5.1 岩藻甾醇对人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的作用  22
    1.5.2 岩藻甾醇诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡机制研究  22-23
2 岩藻甾醇诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的作用  23-32
  2.1 引言  23
  2.2 实验部分  23-26
    2.2.1 实验材料  23-25
    2.2.2 实验方法  25-26
  2.3 实验结果  26-31
    2.3.1 MTT比色法检测岩藻甾醇对HL-60细胞增殖的抑制作用  26-27
    2.3.2 荧光显微镜观察细胞形态学变化  27-29
    2.3.3 流式细胞仪检测HL-60细胞周期及细胞凋亡率  29-31
  2.4 本章小结  31-32
3 岩藻甾醇诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡机制研究  32-46
  3.1 引言  32
  3.2 实验部分  32-36
    3.2.1 实验材料  32-33
      3.2.1.1 实验仪器  32
      3.2.1.2 肿瘤细胞株  32-33
      3.2.1.3 药品及试剂  33
      3.2.1.4 药品及试剂的配制  33
    3.2.2 实验方法  33-36
  3.3 实验结果  36-45
    3.3.1 激光共聚焦扫描显微镜检测岩藻甾醇对HL-60细胞Fas蛋白表达的影响  36-38
    3.3.2 激光共聚焦扫描显微镜检测岩藻甾醇对HL-60细胞FasL蛋白表达的影响  38-40
    3.3.3 激光共聚焦扫描显微镜检测岩藻甾醇对HL-60细胞FADD蛋白表达的影响  40-42
    3.3.4 激光共聚焦扫描显微镜检测岩藻甾醇对HL-60细胞Caspase-8蛋白表达的影响  42-44
    3.3.5 岩藻甾醇对HL-60细胞Caspase-8活性的影响  44
    3.3.6 岩藻甾醇对HL-60细胞Caspase-3活性的影响  44-45
  3.4 本章小结  45-46
4 讨论  46-49
  4.1 岩藻甾醇对人早幼粒白血病HL-60细胞增殖和凋亡的影响  46-47
  4.2 岩藻甾醇诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的机制研究  47-49
结论  49-50
参考文献  50-56
附录  56-57
攻读学位期间发表的学术论文  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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