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微囊藻毒素LR刺激HEK293细胞产生的PP2A调节机制及其对细胞凋亡命运的影响

作　者: 李覃
导　师: 徐立红
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 微囊藻毒素LR 蛋白磷酸酶2A 神经酰胺 α4蛋白细胞骨架细胞凋亡
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水体富营养化以及由此造成的蓝藻爆发是当今人类面临的严重问题。这其中微囊藻属藻爆发引起的水体微囊藻毒素(MCs, microcystins)污染对人类的健康的影响尤其令人关注。例如,微囊藻毒素LR(MCLR, microcystin-LR)具有肝毒性、肾毒性、神经毒性等,且是毒性最强的微囊藻毒素之一。研究显示,MCLR既能造成细胞凋亡,又具有促肿瘤作用。然而,细胞暴露于MCLR后,其命运的决定因素尚待揭示。蛋白磷酸酶2A(PP2A, protein phosphatase2A)是MCLR在细胞内的主要靶点。PP2A在细胞内具有重要的作用,参与几乎所有细胞生理活动,包括细胞增殖、细胞代谢、细胞分化和转变、DNA修复、细胞凋亡等。PP2A全酶由结构亚基(PP2A/A)、活性亚基(PP2A/C)以及调节亚基(PP2A/B)组成。其中,调节亚基决定PP2A全酶的下游底物、亚细胞定位以及具体的生理功能。目前已发现有75种PP2A全酶,各全酶都具有众多的底物。此外,还有一小部分PP2A/C亚基与a4蛋白结合但只具有较低的活性。这一结合状态与细胞在应激状态下对PP2A活性的调节具有重要的关联。已有研究表明,MCLR直接与PP2A的活性亚基(PP2A/C)结合而造成的PP2A活性损失是MCLR造成细胞损伤的重要机制。但是,除开直接与PP2A/C结合以抑制其活性之外,MCLR是否影响PP2A其他亚基,以及MCLR如何具体影响细胞内PP2A全酶的活性则尚不明晰。此外,因为PP2A具有重要的生理功能,细胞在应激状态下对于PP2A的活性具有密切的调控,例如PP2A/C磷酸化、甲基化等翻译后修饰；产生神经酰胺后激活一部分PP2A(CAPP, ceramide activated protein phosphatase);α4蛋白与低活性PP2A解离以代偿活性损失等。由此我们提问：细胞应对MCLR的影响会产生哪些调节机制；这些调节机制是否足够代偿MCLR对细胞内PP2A的活性抑制作用,以及随之会产生哪些细胞学效应?根据前期实验的蛋白质组学研究发现,细胞暴露于MC后,细胞内众多信号蛋白发生改变,并且这些信号蛋白大多与PP2A相关。由此本研究假设,细胞暴露于MCLR后,细胞内PP2A的活性,尤其是其全酶的活性,以及细胞对PP2A的调节机制,对于细胞命运的决定具有重要的作用。本研究选取人胚肾细胞系(HEK293, Human Embryonic Kidney293)这一肾脏来源的细胞作为研究对象,运用免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光等方法,研究在MCLR对其细胞活力没有严重致死效应的条件下,HEK293细胞内PP2A亚基水平和活性的变化、PP2A底物磷酸化水平、PP2A活性调节机制、细胞骨架和细胞黏连蛋白的形态、细胞命运的选择。此外,本研究还选取小鼠作为活体研究对象,验证MCLR的肾脏毒性。主要结果：1. MCLR直接与HEK293细胞内PP2A/C亚基结合。在本实验浓度下,MCLR对细胞活力有下调的趋势,但并无严重的抑制效应。2. MCLR不影响细胞内PP2A/A, PP2A/C和PP2A/B56δ蛋白水平,但上调PP2A/B55α和PP2A/B56α蛋白水平；MCLR下调细胞内PP2A/C甲基化,但不影响其磷酸化；MCLR引起PP2A与其泛素连接酶Mid1解离；高浓度MCLR造成PP2A/A和PP2A/C部分解离；MCLR引起PP2A/B55α部分聚集于高尔基体,但对PP2A/C和PP2A/B56α亚基定位影响不明显；MCLR引起细胞内PP2A/C和α4蛋白解离,并且造成α4蛋白定位于细胞核。3. MCLR对细胞内PP2A总体活性影响呈低浓度刺激活性、高浓度抑制活性。4. MCLR引起HEK293细胞生成神经酰胺。用神经酰胺合成酶抑制剂DESI共处理细胞后,MCLR引起的PP2A/B55α和PP2A/B56α蛋白水平上调效应消除；低浓度MCLR引起PP2A活性上调效应消除；高浓度MCLR对PP2A的活性抑制作用增强,以致PP2A活性几乎完全被抑制。5. MCLR引起PP2A/B56a全酶的下游底物c-Myc磷酸化降低,但不影响其蛋白水平；PP2A/B56a全酶下游底物Bad蛋白水平升高,磷酸化比例降低。MCLR还引起凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白水平降低,但不影响Bax蛋白水平。与DESI共处理后,MCLR对Bcl-2和Bad蛋白水平的改变减弱。MCLR还引起p38MAPK以及JNK蛋白磷酸化上调。6. MCLR引起HEK293细胞形态改变。MCLR引起细胞微丝蛋白解聚,中间纤维之一的波形蛋白和微管蛋白聚缩,这一现象与神经酰胺处理HEK293细胞后细胞骨架的改变相似。与DESI共处理后,MCLR对细胞骨架的改变减弱。MCLR还引起骨架相关蛋白Rac1和Mid1定位于细胞核。7. MCLR引起HEK293细胞粘着斑蛋白形态改变,并引起细胞贴壁能力减弱。MCLR引起细胞核聚缩化和片段化,引起细胞凋亡。与DESI共处理后,MCLR对细胞贴壁的影响以及刺激细胞凋亡的效应减弱。8.小鼠腹腔注射MCLR毒素后,肾脏可检测神经酰胺的生成,并可检测到升高的细胞凋亡。主要结论：MCLR不但能直接与HEK293细胞内PP2A结合,还能引起细胞对PP2A的调节作用,包括产生神经酰胺,PP2A/C与α4蛋白解离等。此外,MCLR对细胞骨架、细胞贴壁以及细胞凋亡产生的影响与神经酰胺相关,并且与α4蛋白与PP2A/C解离后失去原有功能的推论相符合。MCLR还能刺激小鼠肾脏产生神经酰胺并产生细胞凋亡。本实验结果显示PP2A全酶活性及细胞对PP2A的调节作用对于细胞暴露于MCLR的凋亡命运的决定具有重要的作用。

全文目录

致谢  5-7
摘要  7-10
Abstract  10-14
目次  14-16
1 引言  16-23
2 实验材料  23-35
3 研究方法  35-42
4 实验结果  42-75
  4.1 MCLR可进入HEK293细胞但在本实验条件下不对细胞活力产生严重影响  42-46
    4.1.1 MCLR可进入HEK293细胞  42-45
    4.1.2 MCLR在本实验条件下不对细胞活力产生严重影响  45-46
  4.2 MCLR影响HEK293细胞PP2A活性及PP2A亚基蛋白水平和翻译后修饰.  46-51
    4.2.1 MCLR对细胞内PP2A活性的双重效应  46-48
    4.2.2 MCLR影响细胞内PP2A亚基蛋白水平和翻译后修饰  48-51
  4.3 MCLR造成HEK293细胞内α4和PP2A/C解离并影响PP2A核心酶及相关蛋白  51-55
    4.3.1 MCLR造成α4和PP2A/C解离  51-52
    4.3.2 MCLR造成α4和PP2A/C相对细胞定位改变  52-53
    4.3.3 MCLR影响PP2A核心酶结合  53-54
    4.3.4 MCLR影响p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化  54-55
  4.4 MCLR刺激HEK293细胞生成神经酰胺调节PP2A及下游蛋白  55-65
    4.4.1 MCLR刺激细胞生成神经酰胺  55-57
    4.4.2 MCLR刺激细胞调节PP2A与神经酰胺相关  57-59
    4.4.3 MCLR影响部分PP2A下游蛋白磷酸化且与神经酰胺相关  59-62
    4.4.4 MCLR影响PP2A/B55α亚基蛋白定位与神经酰胺相关  62-65
  4.5 MCLR影响HEK293细胞骨架、细胞贴壁以及造成细胞凋亡  65-73
    4.5.1 MCLR影响α4和骨架相关蛋白Rac1共定位  65-67
    4.5.2 MCLR影响α4和骨架相关蛋白Mid1共定位  67-68
    4.5.3 MCLR影响细胞骨架且与神经酰胺相关  68-70
    4.5.4 MCLR影响细胞贴壁且与神经酰胺相关  70-72
    4.5.5 MCLR引起细胞凋亡且与神经酰胺相关  72-73
  4.6 活体染毒MCLR促进神经酰胺生成以及细胞凋亡  73-75
    4.6.1 MCLR造成小鼠肾脏神经酰胺水平上升  73-74
    4.6.2 MCLR造成小鼠肾脏细胞凋亡上升  74-75
5 讨论  75-81
  5.1 受MCLR影响的细胞中,PP2A活性对于细胞命运的决定具有重要作用  76-77
  5.2 MCLR对细胞内PP2A活性影响的双重效应以及可能的机制  77-78
  5.3 α4对PP2A的调节以及可能产生的细胞学效应  78-79
  5.4 细胞产生神经酰胺对PP2A的调节以及可能的细胞学效应  79-81
6 结论  81-82
参考文献  82-94
综述  94-110
  参考文献  103-110
作者简历及在学期间参加的科研工作  110-112

微囊藻毒素LR刺激HEK293细胞产生的PP2A调节机制及其对细胞凋亡命运的影响

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