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RNA干扰在对虾抗病毒免疫中的作用

作　者: 黄添枝
导　师: 章晓波
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: miRNA WSSV vp28-siRNA Ago1 Drosha
分类号: Q71
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndromic Virus, WSSV),是一种严重危害对虾养殖业的主要病原,目前还未找到有效的防治方法。小干扰RNA (siRNA)介导的RNA干扰是真核生物抵抗RNA病毒侵染的一种免疫机制,但动物是否可以利用siRNA途径来抵抗DNA病毒的侵染,迄今还未见到相关报道。在本研究中,我们发现感染有双链DNA病毒(WSSV)的日本对虾可以产生具有抗病毒作用的siRNA (vp28-siRNA)。这一siRNA与WSSV的感染有着密切的联系,它的产生和作用依赖于宿主的Dicer2和Ago2蛋白。利用荧光原位杂交技术,我们发现在vp28-siRNA存在于病毒感染48h后的血淋巴细胞胞浆中。Dicer2的表达沉默导致了vp28-siRNA的表达缺失和病毒复制的加快。锁核酸(LNA)修饰的反义核酸可以有效抑制vp28-siRNA的作用,导致病毒基因组拷贝数在病毒感染24-48h后显著上升。本研究首次表明了动物可以利用siRNA途径来抵抗DNA病毒的侵染。Micro RNA (miRNA)是在转录后水平上调节基因表达的一种的非编码小RNA,参与真核生物很多细胞过程。有报道表明病毒的侵染可以导致宿主]miRNA的表达发生变化,但目前,对病毒感染相关海洋无脊椎动物miRNA的研究还未见报道。本论文以日本对虾(Marsupenaeus japonicus)作为试验材料,对WSSV感染不同时间段(0、6、24和48h)的对虾淋巴器官中的小RNA进行高通量测序。我们共鉴定了63条对虾miRNA,包括48条保守的miRNA(可归为43个家族)和15条对虾物种所特异的miRNA。其中,有31条miRNA在病毒感染后发生了显著的差异表达,包括上调表达的25条和下调表达的6条。利用TargetScan和miRanda软件,我们对差异表达的miRNA进行靶基因预测,并发现大多数靶基因与宿主的免疫反应有关。GO分析结果表明,这些差异表达的miRNA参与各种免疫信号途径。通过进化分析,我们发现miR-1、miR-7和]miR-34在对虾、果蝇和人类中序列高度保守并参与相似的途径。本研究首次对病毒感染相关的海洋无脊椎动物miRNA进行高通量测序和鉴定,揭示了miRNA在介导宿主和病毒间相互作用的分子机制。越来越多的哺乳动物细胞研究表明宿主miRNA在宿主抗病毒免疫中发挥着重要的作用,而有关无脊椎动物miRNA的抗病毒作用的研究目前还非常少。根据前面的结果,我们发现对虾miR-7在WSSV感染过程中发生了显著上调表达,并可以靶向WSSV早期基因wsv477的3’编码区(3’UTR),意味着宿主]miR-7很可能参与病毒的DNA复制过程。在昆虫High Five细胞中,我们验证了体外合成的miR-7模拟物可以显著降低携带有wsv4773’UTR的荧光质粒的表达。当rniR-7模拟物的作用被锁核酸修饰的anti-miR-7(AMO-miR-7)抑制后,荧光质粒的表达又恢复到正常水平。体内试验结果表明,miR-7的过表达可以导致WSSV基因组拷贝数在病毒感染72h和96h后下降到对照组(只注射WSSV)的1/1000。相反地,AMO-miR-7抑制内源性miR-7后,WSSV基因组拷贝数较对照组上升了一个数量级。研究还发现,miR-7的产生依赖于Dicer1蛋白。因此,本研究揭示了无脊椎动物miRNA及其病毒靶基因在宿主和病毒间存在着相互作用。近年来越来越多的研究发现,动物DNA病毒在侵染宿主过程中也可以编码自身的miRNA。然而,有关病毒miRNA的作用机制目前还不是很清楚,尤其是无脊椎动物DNA病毒产生的miRNA。本研究对WSSV感染0、6、24和48h后的对虾淋巴器官的小RNA文库中进行深入分析,共鉴定了49条WSSV编码的miRNA。利用Vmir软件预测和]miRNA芯片杂交技术,我们从WSSV感染24和48h后的对虾淋巴器官、血淋巴细胞和腮组织中再鉴定了151条WSSV miRNA。 miRNA芯片杂交结果表明,WSSV miRNA的表达具有组织特异性和时序特异性。利用生物信息学方法,我们对测序获得的49条WSSV miRNA进行靶基因预测和GO分析。通过进一步研究发现,WSSV可以利用自身编码的WSSV-miR-24抑制宿主血淋巴细胞的凋亡反应。体外和体内分析表明,WSSV-miR-24可以通过靶向宿主Caspase8基因的3’UTR印制该基因的表达,从而降低了宿主细胞的凋亡水平和Caspase酶活,促进了WSSV在血淋巴细胞中的存活和复制。本研究综合了小RNA高通量测序、miRNA芯片杂交和生物信息学预测等方法,对WSSV编码的]miRNA进行深入挖掘,并首次揭示了无脊椎动物病毒可以利用自身编码rniRNA对宿主先天性免疫系统进行干预。Argonaute (Ago)蛋白是siRNA和miRNA通路中的关键蛋白,在宿主RNAi抗病毒免疫中发挥着重要的作用。研究发现许多真核生物拥有多个Ago蛋白和异构体,而有关Ago异构体的功能仍知之甚少。本研究发现日本对虾Agol基因产生三种不同转录本,分别是Ago1A、Ago1B和Ago1C,其中Ago1A和Ago1B在PIWI结构域中包含有一段72bp的插入序列。通过荧光定量PCR,我们发现AgolA和Ago1B在对虾淋巴器官和血淋巴细胞中有较高的表达水平并在WSSV感染后发生了显著上调表达,说明了这两个Agol异构体与对虾抗病毒有关。研究发现：Ago1A的表达沉默可以导致病毒基因组拷贝数显著增加。当Ago1BmRNA被特异性siRNA敲低到30-63%水平后,WSSV基因组拷贝数较对照组(只注射WSSV)发生了显著的增加;而进一步敲低Ago1BmRNA至15%以下,WSSV拷贝数较对照组不仅没有显著性增加,反而促进Ago1A mRNA的上调表达。可能是Ago1A的上调表达弥补了Ago1B在宿主抗病毒中的缺失,导致了Ago1B表达沉默后对病毒复制没有明显的影响。与单独抑制Ago1A或Ago1B相比,同时抑制Ago1A和Ago1B的表达导致了宿主对病毒的侵染产生更强的敏感性,而抑制Ago1C对病毒的复制没有任何影响,说明了Ago1A和Ago1B在对虾抵抗WSSV侵染中发挥着关键作用。因此,本研究首次在无脊椎动物中揭示了Ago异构体的产生与抗病毒有关。RNaseⅢ家族成员Drosha是miRNA成熟过程中的第一个关键蛋白,但迄今为止对Drosha蛋白在病毒感染中的作用机制仍不清楚。本研究首次克隆了日本对虾的Drosha基因,并通过序列分析发现该基因可以编码1081个氯基酸残基的多肽。对虾Drosha蛋白包含了两个RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域,与其他物种的Drosha蛋白具有较高的同源性。荧光定量PCR结果表明：Drosha基因在对虾淋巴器官中具有较高的表达水平,并在WSSV刺激后发生了显著的上调表达,说明了该蛋白与对虾的抗病毒有关。Drosha基因的表达沉默不仅影响了]miRNA的成熟,还导致宿主对病毒的敏感性增强,说明了Drosha在对虾抵抗病毒侵染中发挥着重要的作用。RNA干扰在真核生物抵抗RNA病毒侵染中发挥着重要的作用,然而这种保守的抗病毒机制是否也是无脊椎动物抵抗DNA病毒侵染的一种重要的免疫机制,目前还不是很清楚。本论文以日本对虾作为试验材料,研究非编码小RNA(siRNA和miRNA)和RNAi途径中的关键蛋白(Drosha、Dicer和Ago)在WSSV侵柒宿主过程中的相关分子机制,揭示了RNAi通路在无脊椎动物抵抗DNA病毒侵染中发挥着关键的作用。

全文目录

摘要  10-13
Abstract  13-18
引言  18-44
  1.1 对虾养殖与白斑综合症病毒  18-20
  1.2 RNA干扰  20-21
  1.3 miRNA  21-26
    1.3.1 miRNA的产生和作用途径  21-23
    1.3.2 miRNA的功能  23-26
  1.4 病毒编码的miRNA  26-29
    1.4.1 病毒miRNA的产生和作用途径  27-28
    1.4.2 病毒miRNA的功能  28-29
  1.5 病毒来源的siRNA  29-32
    1.5.1 病毒siRNA的扩增  30
    1.5.2 病毒siRNA在宿主抵抗RNA病毒侵染中的作用  30-31
    1.5.3 病毒siRNA在宿主抵抗DNA病毒侵染中的作用  31-32
  1.6 RNAi关键蛋白  32-43
    1.6.1 Drosha  32-35
    1.6.2 Dicer  35-36
    1.6.3 Argonaute  36-43
  1.7 本论文研究的目的及意义  43-44
材料与方法  44-75
  2.1 材料  44-48
    2.1.1 试验用动物、细胞、菌株和质粒  44
    2.1.2 主要试剂  44-45
    2.1.3 主要仪器设备  45-46
    2.1.4 常用溶液和培养基  46-48
  2.2 方法  48-75
结果与分析  75-155
  3.1 siRNA途径在动物抵抗DNA病毒侵染中的作用机制  75-89
  3.2 miRNA在宿主-病毒相互作用中的分子机制  89-155
    3.2.1 WSSV感染相关的对虾miRNA分析  89-100
    3.2.2 对虾miRNA的抗病毒功能  100-116
    3.2.3 WSSV miRNA的鉴定和功能分析  116-135
    3.2.4 Argonaute1异构体的抗病毒作用  135-145
    3.2.5 对虾Drosha基因的克隆和功能分析  145-155
讨论  155-165
小结与展望  165-169
参考文献  169-186
附录1  186-194
附录2  194-195
致谢  195

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 生物大分子的结构和功能
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