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大黄鱼三种胃肠肽基因的克隆及表达特性研究

作　者: 崔文涛
导　师: 吕振明
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 大黄鱼胃肠肽基因克隆实时荧光定量PCR 表达特性饥饿
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大黄鱼(鲈形目，石首鱼科)是我国的重要海水养殖种类。养殖过程中逐渐凸现的性早熟问题极大地影响了养殖效益和人们对于大黄鱼的认可。深入开展关于鱼类性早熟机理研究，探索其解决方法，是实现其健康养殖的可靠保障。胃肠肽是一类由胃肠道分泌的神经递质类多肽激素，很多研究都表明其能通过调控下丘脑-垂体-性腺生殖轴来调控鱼类的性成熟水平，这提示其在营养-性成熟偶联关系中扮演了重要的中介角色。但是有关鱼类胃肠肽的研究目前仍处于起步阶段，而关于石首鱼科鱼类胃肠肽的研究还鲜见报道。本研究对石首鱼科鱼类大黄鱼三种主要胃肠肽胆囊收缩素、胃促生长素及瘦素基因进行克隆，并对其表达特性及饥饿对其表达的影响进行了分析研究，拟为最终阐述其对性成熟的影响奠定基础。主要研究结果如下：1．使用RACE技术获取了三种胃肠肽的cDNA全长序列并使用相关软件对其进行分析。大黄鱼胆囊收缩素cDNA全长900个碱基(GenBank注册号：KC899121)，其中第167-574个碱基为其开放阅读框，编码137个氨基酸残基组成的多肽序列，其中N-端20个氨基酸残基组成其信号肽序列。大黄鱼胆囊收缩素是一种亲水蛋白，其肽链主要由3个螺旋，1个折叠和无规则卷曲构成。在相近物种中胆囊收缩素多肽序列差异较小，而在进化关系较远物种之间其序列差异较大，表现出明显的种系间保守性特征。在多肽的C-末端附近有一处7个氨基酸残基组成的保守区域，为胆囊收缩素活性中心，在各个物种中变化较小。大黄鱼胃促生长素cDNA全长为697个碱基(GenBank注册号：KC899122)，其中第98-424个碱基为其开放阅读框，编码108个氨基酸残基组成的多肽序列，其中N-端26个氨基酸残基组成其信号肽序列。大黄鱼胃促生长素是一种亲水蛋白，其肽链主要由4个螺旋，2个折叠及无规则卷曲组成。胃促生长素在相近物种中肽链差异也较小，而在进化关系较远物种之间差异也较大，也表现出明显的种系间保守性特征。在胃促生长素成熟肽的N-端有5个氨基酸残基组成的保守区域，为大黄鱼胃促生长素活性中心，在各个物种中变化较小。大黄鱼瘦素cDNA全长1290个碱基(GenBank注册号：KC899123)，其中第143-628个碱基为其开放阅读框，编码161个氨基酸残基组成的多肽序列，其中N-端20个氨基酸残基组成其信号肽序列。大黄鱼瘦素是一种疏水蛋白，其肽链主要由5个螺旋组成，其中后4个属于瘦素的结构特征。瘦素在相近物种中肽链差异较小，而在进化关系较远物种之间其差异较大，仍表现出明显的种系间保守性特征。瘦素没有明显的保守区域。2．利用实时荧光PCR技术分析三种胃肠肽基因在不同组织内的表达情况，发现三种基因在脑、胃、小肠、性腺、脂肪、心脏、肝脏、肌肉、脾脏等9种组织中均有表达，但在不同组织内的表达情况是有差异的。大黄鱼胆囊收缩素基因在脑、胃和小肠中表达水平最高，其中脑和胃的表达量无显著性差异(p>0.05)，而在肌肉和脾脏中表达水平最低。其表达量按照脑、胃、小肠、性腺、脂肪组织、心脏、肝脏、肌肉、脾脏依次降低，而脑、胃和小肠组织表达量显著高于其他组织(p<0.05)。大黄鱼胃促生长素基因在胃和小肠中表达水平最高，而在脾脏中表达水平最低。其表达量按照胃、小肠、脑、肝脏、心脏、性腺、肌肉、脂肪、脾脏依次降低，而胃和小肠组织表达量显著高于其他组织(p<0.05)。大黄鱼瘦素基因在各个组织中都有不同水平的表达，其中在肝脏中表达水平最高，而在脾脏中表达水平最低。其表达量按照肝脏、脂肪、肠、胃、性腺、脑、肌肉、心脏、脾脏依次降低，其中肝脏中的表达量显著高于其他组织(p<0.05)，其他组织的表达量之间无显著性差异(p>0.05)。3．为研究营养状况对3种胃肠肽表达的影响，采用实时荧光定量PCR法分析上述胃肠肽基因表达水平对饥饿的反应。结果发现：随着饥饿实验的逐步推进，大黄鱼脑组织和小肠中胆囊收缩素表达水平呈现出不同的变化趋势。其中在脑组织内胆囊收缩素表达量呈现下降的趋势，前2天胆囊收缩素的表达量无显著性变化(p>0.05)，但第4天表达量便开始出现显著性下降(p<0.05)，到第8天时胆囊收缩素表达量已接近对照组的三分之二。而小肠内胆囊收缩素表达量呈现先上升后下降的趋势，其中前2天胆囊收缩素的表达量无显著性差异(p>0.05)，第6天开始胆囊收缩素表达量显著高于对照组(p<0.05)；此时胆囊收缩素表达量达到最高，第8天胆囊收缩素表达量开始降低，但仍显著高于对照组(p<0.05)。大黄鱼胃促生长素表达水平呈现出波浪式上升的趋势。在小肠中，第2天胃促生长素表达量即开始显著高于对照组(p<0.05)，在第4天达到最高值，虽在第6天、第8天有所下降，但仍显著高于对照组(p<0.05)。在胃中，胃促生长素在第4天表达量才开始显著性高于对照组(p<0.05)，第6天达到最高值，第8天有所下降，但仍显著高于对照组(p<0.05)。大黄鱼瘦素表达水平呈现逐步下降的趋势。在肝脏中，瘦素的表达量在第4天开始显著性低于对照组(p<0.05)，此后逐渐降低，在实验的第8天表达量达到最低。在脂肪组织中，第2天瘦素的表达量相对对照组即出现显著性下降(p<0.05)，此后也持续下降，到实验第8天瘦素水平达到最低。提示三种胃肠肽对能量状态变化的不同反应及其对营养摄取的调控。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-16
第一章引言  16-18
第二章动物胃肠肽的研究进展  18-33
  2.1 胃肠肽的研究历史及其概述  18-20
    2.1.1 胃肠肽的定义和发现  18
    2.1.2 胃肠肽的基本特征  18-19
    2.1.3 胃肠肽的主要种类  19
    2.1.4 胃肠肽分泌与摄食及营养的关系  19-20
  2.2 主要胃肠肽的结构和功能  20-29
    2.2.1 胆囊收缩素  20-23
    2.2.2 胃促生长素  23-26
    2.2.3 瘦素  26-29
  2.3 胃肠肽与性成熟关系  29-31
    2.3.1 胃肠肽对下丘脑-垂体-性腺生殖轴的影响  29-30
    2.3.2 胃肠肽对 kisspeptin 促分泌作用  30-31
    2.3.3 营养-胃肠肽-性成熟的偶联关系  31
  2.4 本研究的意义  31-33
第三章大黄鱼三种胃肠肽基因的克隆及序列分析  33-65
  3.1 材料获取  33
  3.2 仪器和试剂  33-35
    3.2.1 仪器  33-34
    3.2.2 试剂及相关溶液配制  34-35
  3.3 实验方法  35-40
    3.3.1 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成  35-36
    3.3.2 三种胃肠肽核心序列的扩增  36-38
    3.3.3 cDNA 末端快速扩增(RACE)  38-40
    3.3.4 序列的拼接及分析  40
  3.4 实验结果  40-62
    3.4.1 总 RNA 提取结果  40-41
    3.4.2 核心片段 PCR 产物检测结果  41-42
    3.4.3 5'RACE 和 3'RACE 结果  42
    3.4.4 大黄鱼胆囊收缩素 cDNA 全序列及其分析  42-49
    3.4.5 大黄鱼胃促生长素 cDNA 全序列及其分析  49-55
    3.4.6 大黄鱼瘦素 cDNA 全序列及其分析  55-62
  3.5 讨论  62-65
    3.5.1 大黄鱼胆囊收缩素，胃促生长素和瘦素的结构特征  62-63
    3.5.2 鱼类胆囊收缩素，胃促生长素和瘦素的保守性及其对今后胃肠肽基因研究的启示  63-65
第四章大黄鱼三种胃肠肽表达的组织特异性  65-74
  4.1 材料获取  65
  4.2 仪器和试剂  65
  4.3 实验方法  65-67
    4.3.1 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成  65
    4.3.2 引物设计及 PCR 检测  65-66
    4.3.3 荧光实时定量 PCR  66
    4.3.4 数据的分析和处理  66-67
  4.4 结果与分析  67-71
    4.4.1 总 RNA 提取结果  67
    4.4.2 大黄鱼胆囊收缩素基因表达的组织特异性结果  67-69
    4.4.3 大黄鱼胃促生长素基因表达的组织特异性结果  69-70
    4.4.4 大黄鱼瘦素基因表达的组织特异性结果  70-71
  4.5 讨论  71-74
    4.5.1 大黄鱼胆囊收缩素在不同组织内相对表达量分析及讨论  71-72
    4.5.2 大黄鱼胃促生长素在不同组织内相对表达量分析及讨论  72
    4.5.3 大黄鱼瘦素在不同组织内相对表达量分析及讨论  72-74
第五章饥饿对大黄鱼三种胃肠肽基因表达的影响  74-83
  5.1 材料获取  74
  5.2 仪器与试剂  74
  5.3 实验方法  74-75
    5.3.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成  74-75
    5.3.2 饥饿对大黄鱼三种胃肠肽基因表达影响的定量分析  75
    5.3.3 数据的处理和分析  75
  5.4 结果与分析  75-81
    5.4.1 总 RNA 提取及 PCR 扩增结果  75
    5.4.2 饥饿对大黄鱼胆囊收缩素基因表达的影响  75-77
    5.4.3 饥饿对大黄鱼胃促生长素基因表达的影响  77-79
    5.4.4 饥饿对大黄鱼瘦素基因表达的影响  79-81
  5.5 讨论  81-83
    5.5.1 饥饿对大黄鱼胆囊收缩素基因表达的影响  81-82
    5.5.2 饥饿对大黄鱼胃促生长素基因表达的影响  82
    5.5.3 饥饿对大黄鱼瘦素基因表达的影响  82-83
结论  83-84
参考文献  84-92
致谢  92-93
在读期间发表的学术论文及研究成果  93

大黄鱼三种胃肠肽基因的克隆及表达特性研究

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