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柞蚕微孢子虫检测及感染柞蚕中肠转录组及蛋白质组学研究

作　者: 姜义仁
导　师: 段玉玺; 秦利
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 有害生物与环境安全
关键词: 柞蚕 柞蚕微孢子虫 转录组 蛋白质组 检测
分类号: S885.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


柞蚕（Antheraea pernyi Guérin-Méneville，1855）为鳞翅目大蚕蛾科的泌丝昆虫，是中国特有的生物资源，我国年产柞蚕茧约7×104t，占世界野蚕丝总产量的90%以上。柞蚕微孢子虫病是柞蚕生产上主要病害之一，致病病原物为柞蚕微孢子虫（Nosemapernyi），该病在我国柞蚕产区均有分布，近年来由于柞蚕微孢子虫病的发生及蔓延给柞蚕生产带来了严重的经济损失，已成为严重制约柞蚕产业发展的重要因素之一。因此，开展柞蚕微孢子虫病的侵染机制、病害的诊断检测及防治技术等研究对于保障柞蚕产业的健康发展具有重要意义。本研究利用Percoll密度梯度离心技术分离纯化了柞蚕微孢子虫，通过感染微孢子虫的柞蚕幼虫血淋巴蛋白质SDS-PAGE电泳及质谱分析鉴定差异蛋白条带，分别采用RNA-Seq技术及iTRAQ技术对感染柞蚕微孢子虫的柞蚕幼虫中肠组织的转录组及定量蛋白质组学研究，分析了健康及患病样品的差异基因及差异蛋白，以期从柞蚕微孢子虫与柞蚕互作方面探讨柞蚕微孢子虫病的发病机制及微孢子虫侵染过程中的关键基因与蛋白，并进行柞蚕微孢子虫病检测技术研究。研究结果如下：1．明确了柞蚕微孢子虫孢子的分离纯化技术，采用差速离心法进行柞蚕微孢子虫孢子的粗提，进而利用Percoll不连续密度梯度（Percoll浓度分别为25%、50%、75%、100%），15000r·min-1离心30min，纯化效果可达到孢子纯净度95%以上。2．分别采用间接竞争ELISA检测法、胶体金免疫层析检测法、PCR技术3种方法进行了柞蚕微孢子虫病检测研究。（1）PCR检测技术：筛选了适合柞蚕微孢子虫及柞蚕基因组DNA的提取方法—斑迹抽提法，针对微孢子虫SSU rRNA序列设计的3对引物均具有较好的柞蚕微孢子虫检测特异性，并选择引物N1/N2验证了检测灵敏度，最低检测量仅需要柞蚕微孢子虫DNA0.47ng，灵敏性较高。（2）间接竞争ELISA检测法：制备柞蚕微孢子虫多克隆抗体，效价为1:104、浓度为3mg·mL-1，该方法检测灵敏度为1.6×105个·mL-1孢子。（3）胶体金检测法：采用双抗夹心法与竞争法2种方法制备的胶体金试纸条检测时间均为10min，检测灵敏度为0.8×107个·mL孢子，且与柞蚕血淋巴无交叉反应，特异性较强，其中，双抗夹心法试纸条颜色明显、清晰、易于判定，更具有实用价值。3．柞蚕5龄雌幼虫感染微孢子虫96h和144h后血淋巴蛋白质分别出现分子质量约28kD（AP28）和44kD（AP44）的2条蛋白条带相对于对照组染色加深的现象，对2个蛋白条带质谱分析共鉴定117个不重复蛋白，其中2个样品同时鉴定蛋白12个，AP28单独鉴定蛋白52个，AP44单独鉴定蛋白53个。AP28和AP44鉴定蛋白中参与到柞蚕免疫系统及刺激应答生物过程的无重复蛋白共有29个，其中AP28中包括：热激蛋白、泛素样蛋白、泛素结合酶E2、保幼激素环氧水解酶、微管结合蛋白、溶菌酶、ADP-核糖基化因子、防御蛋白、肽聚糖识别蛋白等15个；AP44中包括：蛋白酶、DRK、酚氧化酶原、真核翻译起始因子、类免疫球蛋白等10个；二者共有：热激蛋白21.4、抗菌肽等4个。4．采用RNA-Seq技术研究了健康（SM1）和患柞蚕微孢子虫病（SM2）柞蚕中肠组织转录组，并对差异表达基因进行了统计分析。SM1和SM2样本得到的重叠群Contig数分别为56211和60126，平均长度为280nt和256nt，Unigene的数量分别为27496和30801，平均长度为485nt和406nt，将来自同一个物种的SM1和SM2的Unigene进行合并去冗余后得到所有Unigene的量为28000，平均长度为564nt，N50为722nt。对去冗余后的所有Unigene功能注释，16056个Unigenes注释到NCBI nr数据库；与COG数据库比对后共注释到11351个Unigenes，涉及25种功能；GO分析表明，21303个Unigenes被注释到50个GO条目中，其中有6947个基因与细胞组分相关，4081个基因发挥分子功能，10275个基因参与不同的生物学过程；10351个Unigenes共注释到242个代谢通路，其中代谢类通路最多，共1707个、占总量的16.49%。按照FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1条件，对SM2相对于SM1表达差异的Unigene进行筛选，得到差异表达基因8515个，其中上调基因为7150个，下调基因为1365个。差异表达基因的GO分析显示共有5704个DEGs注释到42个GO条目。DEGs的GO-CellularComponent显著富集分析表明，共有624个DEGs富集到细胞组成154个条目中，其中142个DEGs显著富集于4个条目（Q-value≤0.05），包括星状体、细胞骨架、纺锤体、细胞骨架组分；DEGs的GO-MolecularFunction显著富集分析显示，共有1047个差异基因富集于223个条目，分子功能富集于酶调节活性及结合功能，其中106个DEGs显著富集于6个条目（Q-value≤0.05），包括内肽酶抑制因子活性、内肽酶调节因子活性、肽酶抑制因子活性、肽酶调节因子活性、酶抑制因子活性、细胞骨架蛋白结合；DEGs的GO-BiologicalProcess富集分析显示，共有819个差异基因富集于873个条目，209个差异基因显著富集于11个生物过程条目（Q-value≤0.05），分别参与细胞生长调控、轴突导向、蛋白复合体亚基结构、神经元分化过程中细胞形态、大分子复合物解体、胞内大分子复合物解体、蛋白质复合物解体、胞内蛋白质复合物解体、微管解聚、微管聚合或解聚、蛋白解聚。DEGs的Pathway富集分析表明，共有3092个DEGs富集于231个代谢通路，其中2390个DGEs显著富集于34个代谢通路（Q-value≤0.05），主要参与到营养物质代谢与吸收、神经系统互作、病害及与免疫系统相关等通路。5．以柞蚕转录组数据作为参考序列，利用iTRAQ技术对健康（M1）及患柞蚕微孢子虫病（M2）柞蚕中肠组织蛋白质进行了定量蛋白质组学研究，共鉴定蛋白质1987个。鉴定蛋白被注释到46个GO条目，注释到细胞组分本体中共有3642个蛋白，1779个蛋白发挥分子功能，包括11种功能分类，共有5003个蛋白质参与到25个生物学过程，其中与柞蚕病理及抗病生物过程相关的蛋白包括死亡63个、免疫系统过程38个、代谢过程800个、刺激应答289个；1474个柞蚕蛋白被COG功能分为23类，数量最多的是预测仅有全局功能，并有7个蛋白注释为防御机制功能，25个未知功能蛋白，同时发现功能序列在蛋白质组及转录组水平方面表达具有明显的差异；通过对柞蚕蛋白质Pathway分析发现共有1505条蛋白注释到241个代谢通路中，其代谢通路的蛋白最多，与转录组结果相符。通过SM2相对于SM1蛋白表达相对定量比较，共发者表达差异蛋白203个，其中上调蛋白112个，下调蛋白91个。差异蛋白大量被注释到鳞翅目昆虫，其中上调蛋白52.68%、下调蛋白68.13%。差异蛋白GO富集分析表明，在细胞组分本体共有94个差异蛋白被富集到细胞组成73个条目，显著富集于胞外基质组分、胞外基质、胞外区组分、蛋白胞外基质、核糖核蛋白复合体、基膜、胞外区、肌节、横纹肌细丝、肌原纤维、连接丝体组分及连接丝体等组分（P-value≤0.05）；在分子功能本体共有118个差异蛋白被富集到67个分子功能条目，显著富集于结构分子活性、模式结合、多糖结合、糖类结合、糖胺聚糖结合、连接酶、碳碳键形成等分子功能条目（P-value≤0.05），并首次在柞蚕上发现2个具有糖胺聚糖等结合功能蛋白，蛋白ID分别为Unigene14322All及Unigene3787All；在生物学过程本体共有98个差异蛋白被富集到256个生物学过程条目，显著富集于分支链家族氨基酸代谢过程、基因表达、剪接体组装、大分子代谢过程负调控、戊糖代谢过程、肌肉系统过程及核小体组构等生物过程中（P-value≤0.05）。差异蛋白Pathway富集分析表明，共有154个差异蛋白富集于136个代谢通路，显著富集于胞外基质与受体互作通路、代谢通路、半乳糖代谢、甘油磷酸脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、赖氨酸生物合成、糖类消化和吸收、核糖体、淀粉和蔗糖代谢、剪接体、疟疾、扩张性及肥厚性心肌病等14个代谢通路，其中在胞外基质与受体间互作通路中，发现蛋白ID为Unigene21115All、Unigene4217All、Unigene22755All、Unigene14322All、 Unigene842All、 Unigene7641All、 Unigene10826All、Unigene14191All的发生了上调，Unigene3787All发生了下调，这其中包含2个糖胺聚糖结合功能蛋白，即Unigene14322All（2.42倍）及Unigene3787All（0.387倍），表明柞蚕细胞胞外区是柞蚕微孢子虫侵染宿主过程中重要的区域。通过对差异蛋白及与其对应转录本的关联及聚类分析，发现差异蛋白及与其对应的转录本之间关联性为0.2404，聚类结果显示共有44个Unigenes反向相关，43个Unigenes正向相关。

全文目录


中文摘要  10-13
英文摘要  13-19
第一章 柞蚕微孢子虫研究概述  19-42
  1.1 微孢子虫的研究现状  19-28
    1.1.1 微孢子虫的分类学地位及系统发育分析  20-21
    1.1.2 微孢子虫的生物学特性及其侵染规律  21-28
  1.2 柞蚕微孢子虫的研究现状  28-34
    1.2.1 寄生柞蚕的微孢子虫种类及特点  29-30
    1.2.2 柞蚕微孢子虫对柞蚕生长发育的影响  30-32
    1.2.3 柞蚕微孢子虫病检测及其防治研究  32-34
    1.2.4 柞蚕微孢子虫系统发育分析  34
    1.2.5 柞蚕微孢子虫蛋白质研究  34
  1.3 转录组学及蛋白质组学研究  34-39
  1.4 本项目的目的及意义  39-42
第二章 柞蚕微孢子虫纯化及其检测技术研究  42-70
  2.1 材料  42-44
    2.1.1 试验材料  42
    2.1.2 药品试剂及配置  42-43
    2.1.3 主要仪器设备  43-44
  2.2 试验方法  44-51
    2.2.1 柞蚕微孢子虫的分离及纯化  44-45
    2.2.2 基因组 DNA 的制备  45-46
    2.2.3 PCR 扩增及检测  46
    2.2.4 多克隆抗体制备  46-48
    2.2.5 间接竞争 ELISA 反应条件优化  48-49
    2.2.6 间接竞争 ELISA 工作曲线  49
    2.2.7 胶体金颗粒的制备及质量鉴定  49
    2.2.8 胶体金免疫层析试纸条制作  49-51
    2.2.9 试纸条检测试验  51
  2.3 结果与分析  51-64
    2.3.1 柞蚕微孢子虫孢子分离纯化效果  51-55
    2.3.2 基于 PCR 技术的柞蚕微孢子虫检测  55-57
    2.3.3 柞蚕微孢子虫间接竞争 ELISA 检测  57-61
    2.3.4 柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测  61-64
  2.4 小结  64-65
  2.5 讨论  65-70
第三章 柞蚕微孢子虫侵染柞蚕后对其血淋巴蛋白的影响  70-86
  3.1 材料  70-71
    3.1.1 试验材料  70
    3.1.2 药品试剂及配置  70
    3.1.3 主要仪器设备  70-71
  3.2 试验方法  71-73
    3.2.1 柞蚕微孢子虫添食柞蚕幼虫及取样  71
    3.2.2 血淋巴蛋白质 SDS-PAGE 分析  71
    3.2.3 蛋白质胶条鉴定分析  71-73
  3.3 结果与分析  73-82
    3.3.1 柞蚕感染微孢子虫后血淋巴蛋白质的变化  73
    3.3.2 蛋白胶条质谱鉴定分析  73-82
  3.4 小结  82
  3.5 讨论  82-86
第四章 微孢子虫感染后柞蚕转录组分析  86-122
  4.1 材料  87
    4.1.1 试验材料  87
    4.1.2 药品试剂及配制  87
    4.1.3 主要仪器设备  87
  4.2 试验方法  87-96
    4.2.1 试验流程  87-92
    4.2.2 信息分析流程  92-96
  4.3 结果与分析  96-117
    4.3.1 柞蚕中肠 RNA 提取的质量检测  96-97
    4.3.2 柞蚕中肠转录组的产量统计  97
    4.3.3 序列组装  97-101
    4.3.4 Unigene 的功能注释  101-105
    4.3.5 差异表达基因  105-106
    4.3.6 差异表达基因富集分析  106-117
  4.4 小结  117-118
  4.5 讨论  118-122
第五章 微孢子虫感染后柞蚕蛋白质组研究  122-154
  5.1 材料  123-124
    5.1.1 试验材料  123
    5.1.2 药品试剂及配制  123
    5.1.3 主要仪器设备  123-124
  5.2 试验方法  124-127
    5.2.1 试验流程  124-126
    5.2.2 信息分析流程  126-127
  5.3 结果与分析  127-149
    5.3.1 蛋白质检测  127-129
    5.3.2 蛋白质鉴定  129-131
    5.3.3 蛋白质注释信息  131-137
    5.3.4 差异表达蛋白分析  137-149
  5.4 小结  149-150
  5.5 讨论  150-154
第六章 结论  154-156
参考文献  156-172
附录  172-184
致谢  184-185
攻读博士学位期间发表文章  185-186

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 其他蚕类 > 柞蚕（中国柞蚕）
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