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马疱疹病毒1型及4型gG基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

作　者: 田志革
导　师: 曲娟娟
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 马疱疹病毒 gG蛋白 原核表达 间接ELISA 区分
分类号: S858.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis, ER)是马属动物几种高度接触性传染性疾病的总称。其病原体为亲缘关系密切的两种α-疱疹病毒(alphaherpesvirus),分别是马疱疹病毒1型(EHV-1)(?)()马疱疹病毒4型(EHV-4)。EHV-1除了引起呼吸道疾病外,主要可致使妊娠母马发生流产,以及偶尔引起马的神经系统疾病；EHV-4主要导致呼吸道症状,偶尔也可引起妊娠母马的流产。由于两种类型病毒存在着抗原交叉反应性,以致于难以鉴别多抗血清中由EHV-1和/或EHV-4感染后产生的EHV-1和EHV-4抗体。为此,本研究旨在从血清学诊断上建立一种能够区分EHV-1或EHV-4感染的间接ELISA方法。本研究首先对GenBank中EHV-1和EHV-4gG基因氨基酸序列进行比对,C-端区域较N-端区域具有更高的变异,EHV-1gG第1至287个氨基酸与EHV-4gG第1至286个氨基酸同源性为75%,而EHV-1gG第288至350个氨基酸与EHV-4gG第287至382个氨基酸的同源性仅为21%,故根据EHV-1和EHV-4gG基因3’端序列各设计一对引物进行PCR扩增；分别将EHV-1gG基因插入pGEX-6p-1的BamHⅠ和SalⅠ之间构建原核表达载体pGEX-1gG, EHV-4gG基因插入pET-28a(+)的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ之间构建原核表达载体pET-4gG。然后,再分别将pGEX-1gG质粒转化至BL21(DE3)宿主菌,pET-4gG质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌。通过优化表达条件,实现EHV-1和EHV-4gG蛋白的高效表达,分子量分别为35ku和17ku。最后经免疫印迹试验鉴定,所得纯化表达产物均具有良好的抗原性及型特异性。本研究用纯化的EHV-1和EHV-4gG作为抗原建立可区分马鼻肺炎1型和4型抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为0.25ng/μL,血清最佳稀释度为1：400,作用时间为60min,酶标二抗最佳稀释度为1：10000,作用时间为30min,阴阳性界限值分别为0.26和0.31。试验表明这两种方法均具有良好的特异性、重复性；并与国外试剂盒有较好的符合率。本研究不仅为马鼻肺炎的流行病学调查提供了一种简便快速的血清学检测方法,也为马鼻肺炎抗体分型诊断试剂盒的进一步研发奠定了基础。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1. 引言  11-21
  1.1 病毒的概述  11-13
    1.1.1 病毒简介  11
    1.1.2 病毒的分类  11
    1.1.3 病毒形态结构和理化性质  11-12
    1.1.4 病毒的主要糖蛋白及其功能  12-13
  1.2 马鼻肺炎的流行病学  13-14
  1.3 病毒的致病机制与临床症状  14-15
  1.4 病毒的免疫与预防  15-17
  1.5 病毒疫苗的研究  17-18
  1.6 病毒诊断技术  18-20
    1.6.1 病原鉴定  18-19
    1.6.2 血清学试验  19-20
  1.7 目的与意义  20-21
2. 材料与方法  21-36
  2.1 材料  21-26
    2.1.1 病毒与细胞  21
    2.1.2 载体与菌株  21-23
    2.1.3 标准血清及血清样本  23
    2.1.4 常用生物学试剂  23
    2.1.5 主要仪器  23-24
    2.1.6 试验试剂的配制  24-26
    2.1.7 引物  26
  2.2 试验方法  26-36
    2.2.1 病毒DNA的获取  26-27
    2.2.2 EHV-1及EHV-4糖蛋白G(gG)原核表达载体的构建  27-30
    2.2.3 EHV-1及EHV-4糖蛋白G(gG)原核表达及鉴定  30-31
    2.2.4 EHV-1及EHV-4gG基因片段原核表达蛋白的纯化  31-32
    2.2.5 EHV-1及EHV-4 gG基因片段表达产物的Western blot分析  32
    2.2.6 区分马疱疹病毒1型及4型抗体间接ELISA方法的建立  32-36
3. 结果与分析  36-53
  3.1 EHV-1及EHV-4 gG基因片段重组表达载体的鉴定  36-38
    3.1.1 EHV-1及EHV-4 gG基因片段的获得  36-37
    3.1.2 EHV-1及EHV-4 gG基因片段重组表达载体的鉴定  37-38
  3.2 EHV-1及EHV-4gG基因片段在大肠杆菌中的表达  38-40
    3.2.1 重组质粒pGEX-1gG在E.coli内表达的SDS-PAGE检测  38-39
    3.2.2 重组质粒pET-4gG在E.coli内表达的SDS-PAGE检测  39-40
  3.3 EHV-1及EHV-4gG基因片段原核表达蛋白的纯化  40-42
    3.3.1 EHV-1gG基因片段原核表达蛋白的纯化  40-41
    3.3.2 EHV-4gG基因片段原核表达蛋白的纯化  41-42
  3.4 EHV-1及EHV-4gG基因片段表达产物的Western blot分析  42-45
  3.5 区分马疱疹病毒1型及4型抗体间接ELISA方法的建立  45-53
    3.5.1 EHV-1gG检测马疱疹病毒1型抗体间接ELISA方法的建立  45-49
    3.5.2 EHV-4gG检测马疱疹病毒4型抗体间接ELISA方法的建立  49-53
4. 讨论  53-56
  4.1 gG蛋白的选择  53
  4.2 gG蛋白的表达  53-54
  4.3 gG蛋白的纯化  54
  4.4 间接ELISA方法在马鼻肺炎流行病学调查中的应用  54-55
  4.5 分型检测马鼻肺炎抗体的间接ELISA试剂盒的开发前景  55-56
5. 结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-64
攻读硕士期间发表的学术论文  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 马
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