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马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建

作　者: 孙学强
导　师: 陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马疱疹病毒1型 细菌人工染色体 猪链球菌2型 保护性抗原 溶血素突变体 重组病毒
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type1, EHV-1)是马科动物的重要病原之一,临床上多引起呼吸道、流产及神经系统疾病。疱疹病毒拥有庞大的双股DNA基因组,由于其基因组中存在大量非必需基因,有大约30kbp的序列可以被外源基因取代,并且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖,EHV-1可作为表达外源蛋白活疫苗载体,不但可以用于马病的预防,而且最近的研究显示EHV-1有发展为通用载体或者基因治疗载体的潜力。本实验以ATCC标准株438/77株基础,分别克隆其ORF19和20,与含有绿色荧光蛋白和氯霉素抗性报告基因的pHA2相连构建转移载体后,与母本病毒共转染以传统的同源重组方法在ORF19和20之间插入mini-F序列,构建了含有GFP和氯霉素基因的重组病毒,提取重组病毒基因组环状中间体电转至大肠杆菌DH10B感受态细胞,经过PGR和RFLP筛选到多株阳性细菌人工染色体(BAC)克隆,以磷酸钙法转染RK13细胞,结果均拯救出病毒。拯救病毒与转移载体p1920XM通过同源重组进一步删除含有报告基因mini-F序列构建了无痕迹有标记的恢复病毒。野生株、拯救株和恢复株经过噬斑测定和一步生长曲线测定证明各毒株体外培养特性差异不显著,说明本实验所构建的BAC具有感染性,而且mini-F的插入和删除均没有改变病毒的体外培养特性。猪链球菌2型作为一种人畜共患病病原日益受到关注,而溶血素又是其分泌到细胞外的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。通过对其基因序列的分析发现5’约81bp编码的27个氨基酸残基为信号肽序列。本试验通过PCR及融合PCR方法构建载体在大肠杆菌中成功的表达了带有信号肽和无信号肽的SLY,以及将463和464位色氨酸突变为丙氨酸的带有信号肽和无信号肽的溶血素突变体-SLYm。经过蛋白杂交试验证明,表达的重组SLY和SLYm与提取的SS2分泌的SLY分子量完全一致,而且带有的信号肽的SLY和SLYm均能在细菌上清中检测到杂交条带,说明SS2sly基因的信号肽序列同样能够引导在大肠杆菌中成熟的SLY或者SLYm进行跨膜转运,而且转运至细胞外的SLY和SLYm的分子量与SS2的分子量一致,说明其信号肽序列已被切除,而无信号肽的SLY和SLYm的上清中均未检测到。同时通过血平板和96孔板溶血试验证明溶血素突变体失去溶血活性,而野生型SLY不仅能够溶解红细胞而且对PK15.RK13.SUVEC细胞具有毒性,突变体则不能引起任何细胞发生病变。小鼠毒力实验证明所表达的SLY通过腹腔注射和静脉注射均能致死小鼠,而SLYm在同样条件下对小鼠安全。用SLY和SLYm免疫小鼠制备的抗血清均能抑制SS2SLY的溶血活性,提示了463和464为氨基酸的突变虽然灭活其溶血活性,但是仍具备免疫原性其抗血清能够封闭SLY的膜结合结构域阻止其细胞膜的结合。瞬时表达及免疫转印试验证明未经优化的SS2溶血素突变体全基因在PK15细胞中不能被Pcmv启动子启动表达,而优化合成的slyom则能够表达,所表达的溶血素蛋白在PK15细胞中不需要信号肽序列也能实现跨膜转运。MRP被认为是猪链球菌的重要的毒力因子,从病猪体内分离的菌株常常含这种分子。对链球菌致病菌株的MRP进行了克隆、测序,显示N端前47个氨基酸是典型的信号肽,游离于细菌表面,N端有7个带电荷的残基,后面是一个21个氨基酸的疏水孔和一个公认的信号肽酶切位点。剪切掉信号肽得到一个分子量为131094的成熟蛋白,它与136kD的MRP接近。C端有一类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列,本试验通过构建含有mrp片段的真核表达质粒转染细胞后瞬时表达MRP并经免疫转印确定能够在Pcmv启动子启动下表达。应用疫苗预防目前仍旧是防控猪链球菌病有效措施,传统的灭活疫苗仍旧具有需多次注射的局限,新型高效的猪链球菌2型疫苗仍有待于进一步的研究。本试验在所构建的p438/77的基础上,以两步法无痕迹的将mrp基因片段和溶血素突变体分别插入EHV-1基因组内构建了重组病毒,经过免疫转印鉴定能够表达MRP和SLY。重组病毒通过传统的同源重组方法删除了含有氯霉素抗性基因以及gfp的mini-F序列获得4M和4S株。免疫小鼠后以间接ELISA方法检测到4M能够诱导小鼠产生抗MRP特异性抗体,4M株免疫小鼠后能够抵抗致死量的SLY静脉注射的攻击。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
综述部分  11-41
  第一章 马疱疹病毒1型病原学及其作为活病毒载体应用  11-25
    1.EHV-1病毒学特性  11-16
      1.1 病毒分类及形态  11
      1.2 病毒复制  11-12
      1.3 部分糖蛋白及毒力基因  12-15
      1.4 流行  15-16
    2.临床症状  16-17
    3.动物模型  17-18
    4.感染性细菌人工染色体  18-19
    5.EHV-1作为活病毒载体的应用  19-21
      5.1 抗载体免疫及安全性  19
      5.2 外源基因包装能力  19-21
    参考文献  21-25
  第二章 SS2重要的保护性抗原及疫苗研究  25-41
    1.病原学  25
    2.流行病学  25-26
    3.毒力因子及保护性抗原  26-30
      3.1.荚膜多糖(Capsular polysaccharide)  26-27
      3.2.MPR(Muramidase-released protein)和EF(Extra-cellular protein factor)  27
      3.3.溶血素(Suilysin,SLY)  27-29
      3.4.38-kDaprotein  29
      3.5.GDH  29-30
      3.6.次黄嘌呤核苷酸脱氢酶  30
      3.7.TRAG  30
    4.SS2的诊断及防制  30-33
      4.1 SS2的诊断  30-31
      4.2 疫苗的研究、应用及展望  31-33
    参考文献  33-41
实验部分  41-92
  第三章 EHV-1细菌人工染色体构建及鉴定  41-57
    摘要  41-42
    1.材料和方法  42-47
      1.1 转移载体p19_20/HA的构建  42-43
      1.2 转移载体线性化及转染鉴定  43-44
      1.3 重组病毒的构建及纯化  44
      1.4 提取病毒基因组环状中间体  44
      1.5 电转化及p438/77的鉴定  44-45
      1.6 p438/77的传代稳定性及病毒的拯救  45
      1.7 转移载体p1920XM和r_4XM恢复株的构建  45-46
      1.8 病毒体外培养特性的鉴定  46-47
    2.结果  47-52
      2.1 转移载体的构建及鉴定  47-48
      2.2 线性化转移载体转染RK13细胞  48
      2.3 重组病毒4/G株的构建和纯化  48-49
      2.4 病毒基因组环状中间体的提取及电转化大肠杆菌  49
      2.5 p438/77转染RK13拯救病毒  49
      2.6 无痕有标记r_4XM恢复株的构建  49-51
      2.7 体外培养特性的鉴定  51-52
    3.结论和讨论  52
    参考文献  52-56
    ABSTRACT  56-57
  第四章 SS2溶血素突变体在原核和真核细胞中表达、活性及抗原性鉴定  57-76
    摘要  57-59
    1.材料和方法  59-63
      1.1 基因克隆及质粒构建  59-60
      1.2 SS2溶血素的提取及单抗特异性鉴定  60
      1.3 溶血素及突变体的诱导表达及鉴定  60-61
      1.4 转染PK15细胞瞬时表达溶血素突变体  61
      1.5 溶血活性试验  61-62
      1.6 SLY和SLYm的细胞毒性  62
      1.7 小鼠毒力试验  62
      1.8 小鼠免疫试验  62-63
    2.结果  63-70
      2.1 基因克隆及表达载体的构建  63
      2.2 抗链球菌2型溶血素单抗的特异性鉴定  63-64
      2.3 诱导表达及免疫转印鉴定  64-66
      2.4 真核细胞瞬时表达溶血素突变体  66-67
      2.5 溶血活性及抑制试验  67
      2.6 细胞毒性  67-68
      2.7 小鼠的毒力试验  68-69
      2.8 小鼠免疫试验  69-70
    3.结论和讨论  70-72
    参考文献  72-75
    ABSTRACT  75-76
  第五章 表达SS2溶血素突变体及mrp基因片段EHV-1重组病毒的构建  76-92
    摘要  76-77
    1.材料与方法  77-82
      1.1 质粒、细菌、细胞和病毒  77-78
      1.2 DNA聚合酶N752缺失  78-79
      1.3 4△N多中Pcmv启动子的改造  79
      1.4 mrp基因片段瞬时表达及鉴定  79-80
      1.5 表达SS2mrp重组病毒的构建及鉴定  80
      1.6 表达SS2slyom重组病毒的构建及鉴定  80-81
      1.7 删除重组病毒的Mini-F序列  81
      1.8 小鼠免疫试验  81-82
    2.结果  82-88
      2.1 DNA聚合酶N752缺失  82-83
      2.2 4△N株中Pcmv启动子的改造  83
      2.3 mrp基因片段瞬时表达及鉴定  83
      2.4 表达SS2MRP片段重组病毒的构建及鉴定  83-85
      2.5 表达SS2溶血素重组病毒的构建及鉴定  85-86
      2.6 删除重组病毒中mini-F序列  86-87
      2.7 小鼠免疫试验  87-88
    3.结论和讨论  88-89
    参考文献  89-91
    ABSTRACT  91-92
全文总结  92-93
附录引物及说明  93-96
致谢  96

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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