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猪水肿病毒素Stx2e基因突变体原核表达及重组蛋白的免疫生物学特性研究

作　者: 陈燕燕
导　师: 徐建生
学　校: 扬州大学
专　业: 微生物学
关键词: Stx2e突变体原核表达免疫保护性细胞毒性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪水肿病(Edema disease of swine, ED)是断奶仔猪的一种急性致死性疾病,主要由产Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型(Stx2e, Shiga toxin2e)的大肠杆菌引起。Stx2e是致水肿病大肠杆菌的主要毒力因子。抗毒素免疫可以保护动物免受产毒素大肠杆菌的侵袭,并已经成为水肿病研究的重点之一,毒素或类毒素的获取是研究抗毒素免疫机制及效果的关键。制备类毒素的方法主要有两种：一种利用提取的天然Stx2e,然后利用化学灭活的方法制备,但研究表明利用该法制备的类毒素免疫动物会产生影响动物体重增加或导致体重下降的副作用；另外一种是采用基因工程的方法,突变Stx2e的酶活性位点,获得基因工程法生产的类毒素,这种类毒素不需使用化学试剂灭活,对动物的体重等生产性能没有影响。根据GeneBank收录的Stx2e A、B亚基的基因设计了四对引物。一对用于扩增出Stx2eB不包含信号肽的基因序列,两对用于用PCR法将Stx2eA的第167位编码Glu的密码子突变为编码G1n的密码子,第170位编码Arg的密码子突变为编码Lys的密码子,再用最后一对引物用PCR重叠延伸法扩增出突变的不包含信号肽的Stx2eA基因序列。将PCR产物分别与克隆载体pMD18-T simple vector相连接,重组克隆分别命名为pMD18-T-Amu和pMD18-T-B,经酶切鉴定正确后进行序列测定,并将测序结果与GeneBank上收录的Stx2e的A、B基因分别进行比对,A亚基的基因序列同源性结果在99.0%～99.6%之间,其编码的氨基酸序列的同源性为98.3%～99.0%,且成功地将第167位的Glu突变为Gln,第170位的Arg突变为Lys; B亚基的基因序列同源性为99.5%～100%,其编码的氨基酸序列的同源性为98.6%～100%。提取克隆载体pMD18-T-Amu和pMD18-T-B,分别对其进行双酶切,获得Stx2eAmu和Stx2eB基因片段,将两目的片段与原核表达载体pET Duet-1连接,构建同时表达Stx2eA亚单位(突变体)和B亚单位的质粒载体,命名为pET-ABmu,使用两个启动子分别驱动A亚单位和B亚单位在同一载体上表达,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,由SDS-PAGE电泳分析证实Stx2eAmu和Stx2eB获得了表达,蛋白分子量分别约为35kDa和7.5kDa,分别命名为His-Stx2eAmu和Stx2eB,均以包涵体的形式存在,以抗Stx2e血清为一抗,经Westen-blot分析证实表达的两段重组蛋白抗原性良好。用纯化的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作为免疫原,对ICR小鼠进行腹腔注射,以检验重组蛋白的毒性和免疫原性,免疫结束用最低致死剂量的Stx2e粗提毒素进行攻毒,观察重组蛋白对小鼠的免疫保护性；在Vero细胞上测定重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性及免疫鼠血清对Stx2e的中和试验。结果表明,经腹腔注射纯化的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB,小鼠无任何症状,这表明重组表达产物对ICR小鼠安全,腹腔注射可以诱导机体产生有效保护性抗体,并且重组蛋白可以对用最低致死剂量的Stx2e攻毒的ICR小鼠起到完全保护作用；在Vero细胞上,纯化的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB未使细胞产生肉眼可见的细胞病变,但对细胞形成单层的时间有所影响。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
目录  6-7
符号说明  7-8
综述仔猪水肿病的概述及研究进展  8-17
  1 猪水肿病的毒力因子  8-11
  2 猪水肿病的致病机理  11
  3 猪水肿病的诊断  11-13
  4 猪水肿病的免疫研究  13-16
  5 讨论  16-17
研究一 Stx2e A亚单位基因突变体的构建及A(突变)、B亚单位基因的克隆  17-31
  摘要  17
  1 材料  17-18
  2 方法  18-23
  3 结果  23-30
  4 讨论  30-31
研究二 Stx2e基因突变体的原核表达及重组蛋白的抗原性分析  31-44
  摘要  31
  1 材料  31-32
  2 方法  32-37
  3 结果  37-43
  4 讨论  43-44
研究三重组蛋白的免疫生物学特性研究  44-53
  摘要  44
  1 材料  44-45
  2 方法  45-47
  3 结果  47-52
  4 讨论  52-53
结论  53-54
参考文献  54-59
致谢  59-60

猪水肿病毒素Stx2e基因突变体原核表达及重组蛋白的免疫生物学特性研究

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