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不同毒力PRRSV感染仔猪后细胞因子的含量和Sn受体表达水平的比较研究

作　者: 韩梓峰
导　师: 蔡雪辉
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 高致病性猪繁殖与呼吸综合征细胞因子免疫调节受体荧光定量PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是有猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种以母猪的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道症状为特征的严重的传染性疾病。该病与20世纪80年代在美国首次发现,目前已在全世界范围内传播,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2006年,我国暴发了一种以发病猪出现“高热”和“高致死率”为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic PRRS, HP-PRRS),给我国养猪业带来无法估量的损失,经研究证实引发该病的主要病原是HP-PRRSV。本实验对仔猪感染高致病性PRRS HuN4毒株和国内经典PRRS CH-1a毒株进行比较,目的是比较仔猪感染不同毒力PRRSV后产生的细胞因子含量和Sn受体表达量的差异。将45头PRRSV抗原抗体阴性的健康断奶仔猪随机分为3组,每组15头,第1组为HuN4毒株组,第2组为CH-1a毒株组,第3组为对照组。分别于感染后不同的时间点进行采血和剖杀,每天进行体温检测和临床症状的观察,对主要的组织器官进行组织病理学观察,应用荧光定量RT-PCR方法检测血清中和肺组织中的病毒载量,ELISA试剂盒检测IFN-α, IL-1、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、IL-10和TGF-β共9种细胞因子的表达水平,利用建立的荧光定量RT-PCR方法检测Sn受体mRNA的表达水平的差异。实验结果表明,第1组从感染后的3-14d,出现明显体重下降、体温升高和严重的呼吸道症状,同时各组织器官病理损伤明显：第2组出现一过性的发热和呼吸困难；第1组病理组织学变化,各组织器官均出现不同程度的损伤,但病理损伤轻微；第1组血清中和肺组织中的病毒载量均显著高于第2组(P<0.01)；相对第2组能够产生有效地细胞免疫反应,第1组产生炎性因子时间较早,表达水平高,同时上调了多种免疫抑制因子(IL-4、IL-10和TGF-β),推迟细胞免疫反应；第1组Sn受体表达水平前期高于第2组(P<0.01),但感染后期较第1组低(P<0.01)。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-21
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述  11-16
    1.1.1 病原体  11-12
    1.1.2 病毒理化特性  12
    1.1.3 病毒的分子生物学特点  12-14
    1.1.4 临床症状  14-15
    1.1.5 发病机制  15-16
  1.2 高致病性猪繁殖与呼吸综合征  16
  1.3 PRRSV免疫学研究进展  16-17
  1.4 PRRSV感染后细胞因子的应答  17-19
    1.4.1 炎性因子  17-18
    1.4.2 介导细胞免疫的细胞因子  18
    1.4.3 免疫调节因子  18-19
  1.5 PRRSV细胞受体的研究进展  19-20
    1.5.1 硫酸乙酰肝素  19
    1.5.2 唾液酸黏附素  19
    1.5.3 CD163  19-20
  1.6 目的和意义  20-21
2 材料与方法  21-26
  2.1 PRRSV细胞受体Sn和CD163荧光定量RT-PCR方法的建立  21-22
    2.1.1 血液样本和实验动物  21
    2.1.2 试剂和仪器  21
    2.1.3 引物和探针  21-22
    2.1.4 Sn、CD163受体及β-actin重组质粒的构建  22
    2.1.5 反应体系与条件的优化  22
    2.1.6 标准曲线的建立  22
    2.1.7 特异性实验  22
    2.1.8 敏感性实验  22
    2.1.9 重复性实验  22
    2.1.10 样品检测  22
  2.2 不同毒力PRRSV仔猪感染实验  22-26
    2.2.1 病毒株  22-23
    2.2.2 主要实验试剂  23
    2.2.3 主要实验仪器  23
    2.2.4 实验动物  23
    2.2.5 实验设计  23-24
    2.2.6 检测样本的采集  24
    2.2.7 临床症状和剖检变化的观察  24
    2.2.8 病理组织学变化  24
    2.2.9 血清和肺组织中病毒载量的检测  24-25
    2.2.10 血清样品的准备和细胞因子的检测  25
    2.2.11 Sn受体mRNA水平表达量的检测  25
    2.2.12 数据分析  25-26
3 结果  26-41
  3.1 Sn和CD163荧光定量RT-PCR方法的建立  26-30
    3.1.1 Sn、CD163和β-actin的扩增与重组质粒鉴定结果  26
    3.1.2 荧光定量PCR反应的条件优化  26
    3.1.3 标准曲线的建立  26-28
    3.1.4 特异性实验结果  28-29
    3.1.5 敏感性实验结果  29
    3.1.6 重复性实验结果  29-30
    3.1.7 样品检测结果  30
  3.2 仔猪感染实验  30-41
    3.2.1 临床症状、眼观病变和组织病理学变化的差异  30-32
    3.2.2 血清和肺组织中病毒载量的差异  32-34
    3.2.3 血清中细胞因子的变化的差异  34-40
    3.2.4 Sn受体mRNA表达水平的差异  40-41
4 讨论  41-44
  4.1 体温、眼观病变及病理变化的差异  41
  4.2 血清中细胞因子的变化的差异  41-42
  4.3 Sn受体的变化差异  42-44
5 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-57
攻读学位期间发表的学术论文  57

不同毒力PRRSV感染仔猪后细胞因子的含量和Sn受体表达水平的比较研究

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