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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后猪肺泡巨噬细胞的差异表达基因的研究

作　者: 肖燕
导　师: 童光志
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 HuN4株猪肺泡巨噬细胞差异表达基因
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种在世界范围内广泛流行的猪传染性疾病,可引起妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道症状,该病给养猪业造成了巨大的危害。2006年5月,由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株(highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)引起的猪“高热综合症”首先爆发于我国江西,随后迅速扩散到周边省份。到2007年,该病已遍布全国绝大多数省份,使我国养猪业遭受了巨大的损失。与以往的经典PRRSV相比,HP-PRRSV的致病力显著增强,但究竟是何因素导致病毒的致病性增强,到目前为止还没有得到解释。病毒的致病能力取决于两个方面:一是病毒自身结构和毒力的变化,二是机体对于病毒的应答。致病的过程是病毒与机体相互斗争的过程,在这一过程中某些基因被选择性地表达或抑制、某些信号通路发生改变,而这些被选择性表达或抑制的基因很有可能在致病过程中发挥着重要的作用,对机体内差异表达基因的研究有助于了解病毒的致病机制。在体内,PRRSV的主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolar macrophages,PAM)。本研究比较了多株国内外北美洲型PRRSV的ORF7基因,并在其高度保守区设计引物和探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。通过该方法确定了HP-PRRSV HuN4株在PAM细胞上的复制动力学,即在感染后48h病毒拷贝数达到最高值。本研究于HuN4株病毒感染后40h(病毒复制高峰前)提取PAM细胞的总RNA,并利用抑制消减杂交技术(suppressionsubtractive hybridization.SSH)成功构建了HuN4株感染PAM细胞后的正向消减杂交文库(HN文库)和反向消减杂交文库(NH文库)。HN文库中含有HP-PRRSV感染后PAM细胞内表达上调的基因:NH文库则与之相反,它含有感染后PAM细胞内表达下调的基因。随机挑取HN和NH文库各200个克隆进行Southern-blot验证,经序列测定及同源性搜索后主要获得56条差异表达基因,其中34条为表达上调基因,22条为表达下调基因。从功能的角度上看,主要有3类基因发生了变化:即受体类、细胞因子类基因和代谢酶类的基因发生了变化。例如:TCR-α/β,MHCclassⅠ,IL-8,IL-16,TLR6,TLR1,TLR10和AMCF-Ⅰ表达得到上调,cytoskeletal-β和MHC classⅡ表达被抑制。在此基础上,我们选取了28条表达上调基因和16条表达下调基因进行体内试验,即在PRRS病毒及抗体均阴性的仔猪体内人工接种HuN4病毒,定期剖杀采集PAM细胞并检测相关基因的表达情况。相对荧光定量PCR同样证明了这些基因的差异表达情况。我们尝试着将这些差异表达基因通过各自的功能将它们联系起来,形成一个系统的、相互关联的网络结构或信号通路,以期望从这些差异基因内找到进一步深入研究的线索。其中以Toll-like受体并结合NF-κB的途径有可能是一条有价值的线索。以上这些差异表达基因在病毒致病过程中发挥着什么样的作用,还有待下一步的研究去证实。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章绪论  14-29
  1 猪繁殖与呼吸综合征  14-19
    1.1 PRRS概述  14-16
    1.2 PRRS的流行病学  16
    1.3 PRRSV分子生物学特征  16-18
    1.4 PRRSV致病机制  18-19
    1.5 PRRSV的疫苗与防治  19
  2 基因的差异表达  19-27
    2.1 差异表达  19-20
    2.2 筛选差异基因的方法进展  20-23
      2.2.1 消减杂交(SH)  20-21
      2.2.2 差异显示PCR技术(DDRT-PCR)  21
      2.2.3 基因芯片技术(DNA chip technique)  21-22
      2.2.4 基因表达连续分析(SAGE)  22-23
    2.3 SSH概述  23-25
    2.4 SSH优缺点  25-27
    2.5 SSH的应用  27
  3 研究目的和意义  27-29
第二章高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后猪肺泡巨噬细胞的差异表达基因的研究  29-58
  1 材料和方法  30-41
    1.1 毒株、细胞和菌株  30
    1.2 实验动物  30
    1.3 主要试剂与药品  30
    1.4 主要仪器设备  30-31
    1.5 HP-PRRSV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立  31-33
      1.5.1 阳性标准品的制备  31-32
      1.5.2 反应体系与条件的优化  32
      1.5.3 标准曲线的建立  32
      1.5.4 特异性试验  32
      1.5.5 敏感性试验  32
      1.5.6 重复性试验  32-33
    1.6 HP-PRRSV在猪体内复制动力学曲线的研究  33
      1.6.1 PAM细胞的制备  33
      1.6.2 接毒并检测病毒含量  33
      1.6.3 绘制病毒复制动力学曲线  33
    1.7 HP-PRRSV感染PAM细胞后差异表达基因文库的建立  33-35
      1.7.1 细胞总RNA的提取  33-34
      1.7.2 cDNA的合成  34
      1.7.3 cDNA的酶切消化  34
      1.7.4 cDNA片段与接头的连接  34-35
      1.7.5 正向、反向消减杂交  35
      1.7.6 差异基因的PCR扩增  35
      1.7.7 差异基因文库的克隆化及文库片段多样性分析  35
    1.8 Southern blot鉴定差异表达基因文库的效率  35-37
      1.8.1 样品的制备  36
      1.8.2 探针的制备  36
      1.8.3 杂交  36-37
      1.8.4 杂交结果的判定  37
    1.9 阳性差异表达基因序列的测定与注释、序列分析和引物设计  37
    1.10 动物实验  37
    1.11 差异表达基因SYBR Green Ⅰ相对荧光定量RT-PCR检测方法的建立  37-41
      1.11.1 内参GAPDH荧光定量PCR方法的建立  37-38
      1.11.2 目的基因荧光定量PCR方法的建立  38-40
      1.11.3 待检目的样品的制备  40-41
      1.11.4 目的基因的检测  41
      1.11.5 结果分析  41
    1.12 网络分析  41
  2 结果  41-53
    2.1 HP-PRRSV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立  41-44
      2.1.1 荧光定量PCR反应的条件优化  41
      2.1.2 标准曲线的建立  41-42
      2.1.3 特异性试验结果  42
      2.1.4 敏感性试验结果  42-43
      2.1.5 重复性试验结果  43-44
    2.2 HP-PRRSV在猪体内复制动力学曲线的获得  44
    2.3 HP-PRRSV感染PAM细胞后差异表达基因文库的获得  44-46
      2.3.1 酶切效率分析  44-45
      2.3.2 接头的连接效果  45
      2.3.3 两轮PCR的结果分析  45
      2.3.4 文库的cDNA片段多样性分析  45-46
    2.4 差异表达基因文库效率的获得  46
    2.5 差异表达基因序列的获得  46-49
    2.6 差异表达基因SYBR Green Ⅰ相对荧光定量RT-PCR检测方法的建立  49-51
      2.6.1 标准曲线的建立  49-50
      2.6.2 目的基因标准曲线的建立  50
      2.6.3 差异基因相对表达结果  50-51
    2.7 差异基因网络分析  51-53
  3 讨论  53-58
第三章结论  58-59
参考文献  59-66
附录  66-67
致谢  67-68
作者简历  68-69

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后猪肺泡巨噬细胞的差异表达基因的研究

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