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猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制

作　者: 李俊
导　师: 艾洪滨; 王金宝
学　校: 山东师范大学
专　业: 动物学
关键词: 猪圆环病毒2型分离鉴定荧光定量PCR方法动物模型 CpG基序核酸疫苗免疫原性
分类号: S858.28
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)分为无致病性的PCV1和有致病性的PCV2两个基因型。PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病复合征（PRDC）、猪的流产和死亡综合征（SAMS）、猪增生性和坏死性肺炎（PNP）和猪先天性脑震颤（CT）等，并能导致母猪繁殖障碍和引起免疫抑制，给养猪业造成严重的经济损失。该病已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的重要猪传染病。近年来该病毒不断发生变异，新的毒株不断出现，给该病的防控带来了一定的压力。为了深入了解本病的流行情况及研制新型的基因工程疫苗用于该病的防治，本研究在流行病学调查的基础上，分离鉴定了3株PCV2，对17株病毒进行了全基因组克隆测序并进行了PCV2遗传演化分析；调查了PCV2同属的Torque teno virus (TTV)在山东省猪群中的流行情况；建立了荧光定量PCR检测方法和PCV2小鼠动物模型；研制了含CpG基序的PCV2核酸疫苗。主要表现为：对山东省规模化猪场进行了猪圆环病毒感染率的流行病学调查，发现猪圆环病毒的感染率呈逐年上升趋势，2005-2011抗原阳性率由11.3%增加到40.38%，抗体阳性率由38.7%增加到72.99%。混合感染现象仍很严重，二重感染中PCV+CSFV所占比例最大，为33.81%；三重感染中PCV+PRRSV+CSFV所占比例最大，为4.32%。在此基础上完成3株PCV2的分离鉴定工作，并进行了系列生物学鉴定。其中SD株（JQ653449）传代至第20代病毒毒价为106.0TCID50/mL。目前该病毒传至75代，效价稳定可以作为灭活疫苗的候选毒株。完成17株猪圆环病毒的全基因克隆测序。通过与从已公布的国内外PCV2分离株的比较分析发现国内PCV2一直在不断的变异，PCV2b是目前国内流行株，出现PCV2a和PCV2b重组型病毒，其基因组特征为ORF1来自PCV2a，ORF2来自PCV2b。PCV2基因型与地域无明显相关性。国内流行的圆环病毒的遗传演化规律为PCV2a型到PCV2a和PCV2b重组型病毒再到PCV2b型，未发现PCV2c型。对PCV2小鼠动物感染模型的构建进行了初步研究。根据攻毒组小鼠脾脏、淋巴结内持续的病毒复制、血清PCV2抗体生成、明显的病理损伤得出PCV2感染昆明小鼠的结论，本试验初步建立了PCV2感染昆明小鼠的动物感染模型，并发现证明了PCV2可在昆明小鼠中水平传播。这为PCV2的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论基础。建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测PCV2的方法。建立的检测方法特异性强、重复性好；敏感性达10个拷贝；在应用于临床检测时，可将反应时间缩短为1.5小时。为PCV2的临床检测提供了新的方法，并制定了山东省地方标准：猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术（DB37/T 1827-2011），在全省范围内推广应用。克隆了PCV2核衣壳蛋白基因ORF2，并插入到真核表达载体pVAX1中，成功构建pVAX1-ORF2。在前期动物实验的基础上人工合成了2条对猪具有免疫增强作用的CpG基序并成功插入到pVAX1-ORF2真核表达载体，获得2种含CpG基序的CpG-pVAX1-PCV2 ORF2核酸疫苗。对2种核酸疫苗在猪体进行了动物实验，利用试剂盒检测了其抗体效价和IL-2产生水平，并用流式细胞术对其细胞免疫效果进行了测定，对其免疫原性进行了探讨。申报了猪圆环病毒核酸疫苗的转基因安全评价中试，并获批（农基安办字2010-T179）。通过对2种含CpG基序的核酸疫苗猪体试验，确定了最佳的CpG-pVAX1-ORF2及免疫剂量，筛选出的最佳核酸疫苗能够增加猪的平均日增重，并能刺激机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，可有效阻止病毒在体内的增殖。本研究的主要创新点：1、病原流行病学调查结果表明，2005年至2011年，山东省PCV2的感染率呈逐年上升趋势。发现PCV2b是目前国内流行株，出现PCV2a和PCV2b重组型病毒。2）建立了PCV2的荧光定量PCR诊断方法，并制定了山东省地方标准（DB37/T1827-2011），为诊断PCV2感染提供了技术手段。3）建立了PCV2感染昆明小鼠的动物感染模型，发现并证明了PCV2可在昆明小鼠中水平传播。4）在国内外率先研制含CpG基序的CpG-pVAX1-PCV2 ORF2（核酸疫苗），有效提高了核酸疫苗的免疫效果，取得农业部转基因产品中试批文（农基安办字2010-T179）。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
英文缩写符号及中英对照表  10-12
第一部分文献综述  12-27
  一、猪圆环病毒的研究进展  12-25
    1 病原学  12-17
      1.1 分类地位及生物学特性  12-13
        1.1.1 分类地位  12
        1.1.2 PCV 理化特性  12-13
        1.1.3 病毒培养特性  13
      1.2 病毒基因组结构  13-15
      1.3 病毒基因组编码的主要蛋白  15-17
        1.3.1 Rep 蛋白  15-16
        1.3.2 Cap 蛋白  16-17
        1.3.3 ORF3 基因编码的非结构蛋白  17
    2 流行病学  17-19
      2.1 流行情况及分布  17-19
      2.2 易感动物  19
      2.3 传播途径  19
    3 PCV2 诊断技术  19-23
      3.1 病原学方法  20-22
        3.1.1 病毒的分离与鉴定  20
        3.1.2 原位核酸杂交  20
        3.1.3 免疫组织化学试验  20-21
        3.1.4 PCR 技术  21-22
          3.1.4.1 常规 PCR  21
          3.1.4.2 多重 PCR 检测  21
          3.1.4.3 实时荧光定量 PCR 检测  21-22
      3.2 血清学方法  22-23
        3.2.1 免疫过氧化物酶单层细胞试验  22
        3.2.2 间接免疫荧光试验  22
        3.2.3 酶联免疫吸附试验  22-23
    4 疫苗研究进展  23-25
      4.1 PCV2 灭活疫苗  23
      4.2 PCV2 弱毒疫苗  23-24
      4.3 PCV2 亚单位疫苗  24
      4.4 PCV2 核酸疫苗  24-25
  二、CpG 的研究进展  25-27
第二部分实验论文  27-109
  第一章：流行病学调查  27-69
    一：猪圆环病毒 2 型流行病学调查  27-35
      1.1 材料与方法  27-33
      1.2 结果  33-34
      1.3 讨论  34-35
    二：猪圆环病毒 2 型毒株的分离鉴定  35-43
      2.1 材料与方法  35-37
      2.2 结果  37-41
      2.3 讨论  41-43
    三：山东省猪群 TTV 的感染情况及其分子流行病学分析  43-49
      3.1 材料与方法  44-45
      3.2 结果  45-47
      3.3 讨论  47-49
    四：山东省猪圆环病毒 2 型分子特征及遗传演化分析  49-62
      4.1 材料与方法  50-51
      4.2 结果  51-61
      4.3 讨论  61-62
    五：SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立与初步应用  62-69
      5.1 材料与方法  63-64
      5.2 结果  64-68
      5.3 讨论  68-69
  第二章：猪圆环病毒 2 型核酸疫苗研制及动物模型建立  69-109
    六：猪圆环病毒 2 型感染昆明小鼠模型的建立：病毒分布和病理损伤的研究  69-79
      6.1 材料与方法  70-73
      6.2 结果  73-77
      6.3 讨论  77-79
    七：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗的构建  79-86
      7.1 材料与方法  79-83
      7.2 结果  83-84
      7.3 讨论  84-86
    八：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗免疫效力评价  86-101
      8.1 材料与方法  87-93
      8.2 结果  93-99
      8.3 讨论  99-101
    九：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗的中试实验  101-109
结论  109-110
参考文献  110-118
博士期间论文发表情况  118-119
致谢  119

猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制

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