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犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫效果研究

作　者: 苗文丽
导　师: 刘福英；王俊霞
学　校: 河北医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 核酸疫苗 pVAX1-CpG-Loop Beagle犬体液免疫效果中和抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的犬传染性肝炎(Infectious canine hepatitis ICH)是由犬传染性肝炎病毒(ICHV)引起的一种常见的急性败血性传染病,传染性强,无明显季节性,各种品系,不同年龄的犬均可被感染,尤其以六周龄至一岁以内的犬发病率高,死亡率达10～40%,对养犬业和实验犬的饲养均可造成极大的危害。预防本病发生的主要措施就是加强饲养管理,严格兽医卫生措施和定期免疫接种。目前,在实验用犬和其他养犬业,主要采取定期接种ICHV弱毒疫苗的方法。核酸疫苗是近年发展起来的一项新的免疫技术,与传统疫苗相比有诸多优点,被称为第三代疫苗。核酸疫苗免疫接种后,可在动物体内诱导体液免疫应答,对动物产生免疫保护作用。抗体是由抗原刺激B细胞经分化和增殖后产生的免疫球蛋白,因此在机体接受免疫接种以后,检测机体的抗体水平,成为评价机体免疫反应及疫苗免疫效果的一个重要体液免疫指标。中和抗体是病原微生物侵袭机体后,所产生的具有中和相应病原微生物及其毒性产物(毒素),使病原微生物丧失感染能力或毒力的抗体,是进行病毒感染机制研究的重要工具。中和抗体水平的监测是反映疫苗免疫原性的一个重要体液免疫指标。核酸疫苗作为一种新兴的疫苗,大量实验表明在感染性疾病、肿瘤等的预防和治疗方面具有很大的潜力。本研究室采用基因重组技术构建了含有Loop1、Loop2的重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后,诱导小鼠产生针对抗原的特异性IgG抗体和抑制病毒感染的中和抗体。为确定此核酸疫苗对犬的免疫应答效果,本研究采用pVAX1-CpG-Loop对Beagle犬进行免疫,对其体液免疫应答效果进行评价。旨在探索pVAX1-CpG-Loop作为预防犬传染性肝炎核酸疫苗的有效性,为犬传染性肝炎病毒核酸疫苗的开发研究奠定基础。方法1质粒的提取及抗原蛋白的诱导表达和纯化采用SDS-碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1–CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法纯化质粒。并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度和浓度测定。将原核表达质粒pET28a(+)Loop转化大肠杆菌BL21(DE3),摇菌并诱导重组Loop蛋白的表达。用尿素溶解沉淀,采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,透析、复性后浓缩目的蛋白。2实验动物的分组及免疫6只Beagle犬进行随机编号:1号、2号、3号犬:分别于0、8、16周注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,最后一次与相同剂量的抗原蛋白共免疫;4号、5号、6号犬:分别于0、8、16周仅注射重组质粒pVAX1- CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,每只动物均于免疫前经双侧股四头肌注射25﹪灭菌蔗糖1ml/只,15min后于相同部位进行质粒免疫,抗原蛋白免疫于颈部皮下。7号犬:为已接种传统疫苗对照。3攻毒试验在第3次接种6周后,对实验犬进行攻毒试验。取病毒株经MDCK细胞增殖,取MDCK细胞培养物(TCID50为10-4.23/0.1ml),在麻醉状态下,通过口腔粘膜感染病毒,剂量为1 ml/只。4免疫动物的体液免疫效果评价间接ELISA法检测免疫犬特异性IgG抗体,以包被液稀释的犬传染性肝炎病毒(1:5稀释病毒),100μl/孔包被酶联板,4℃过夜;去除包被液,以PBST洗涤3次,20﹪胎牛血清-PBST封闭,37℃于湿盒中放置1h;然后加入待检的不同稀释度的犬血清100μl/孔,37℃于湿盒中放置1h,洗涤3次;加入HRP标记的兔抗狗IgG抗体(1:2000),37℃于湿盒中放置1h,洗涤3次;加入显色底物OPD溶液100μl/孔,避光显色;加入50μl/孔2mol/L H2SO4终止反应。酶标分析仪检测492nm波长下的OD值(OD492)。以P/N大于1.8为阳性。间接免疫荧光试验( IFA )测定血清抗体效价,免疫后静脉采血,分离血清,将待测血清置56℃灭活30min,血清样品用PBS稀释为1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800 6个稀释度,滴加于抗原片上,设PBS为空白阴性对照。在37℃温箱中孵育30min;PBS振荡洗涤3次,每次5 min;加1:200稀释度的羊抗犬IgG FITC标记物,在37℃温箱中孵育30min;PBS振荡洗涤3次,每次5min;加1:2000稀释度的伊文思蓝,在37℃温箱中染色30min; PBS振荡洗涤3次,每次5min;最后用蒸馏水冲洗,室温吹干;用90%缓冲甘油液封片,在荧光显微镜下观察。中和试验测定血清中和抗体效价:收集各犬的血清,灭活后采用固定病毒-稀释血清法进行中和实验。用DMEM将血清样品做连续倍比稀释,分别在上述血清中加入等量的适当滴度的病毒(100TCID50),充分混匀后置于37℃孵育1h;接种至敏感细胞(MDCK),100μl /孔,设两复孔,并设置正常细胞对照;37℃,5% CO2培养箱中孵育1h;弃去血清-病毒混合液,用Hanks液洗涤细胞3次,加入细胞维持液,37℃培养3天观察细胞病变。结果1重组质粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取用碱裂解法大量提取所得的真核重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度和浓度测定,OD260/OD280分别为1.82、1.9、1.88。2 Loop蛋白的诱导、表达和纯化pET28aLoop重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,做SDS-PAGE电泳,诱导表达菌在36 kDa处出现一条蛋白表达条带,对照组无此条带。用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白纯度在95%至98%之间。3间接ELISA测定免疫犬血清IgG水平攻毒前各实验犬产生的特异性抗体无显著变化,其中1号犬及7号犬所产生的抗体效价明显高于其它犬。攻毒后各实验犬所产生的抗体效价均明显增高,7号犬在第一周达到最高值,其它实验犬在第三周达到最高值,后逐渐下降持续至27周。4间接免疫荧光试验(IFA)测定免疫犬血清总IgG抗体水平攻毒前1号、4号、5号和7号实验犬检测到IgG抗体滴度持续为1:10,其余实验犬未检测到特异性抗体。攻毒后,在第五天抗体水平开始升高,其中1号、5号和7号犬达1:50,4号犬仍为1:10,2号、3号和6号犬未检测到IgG抗体。从第一周开始各试验犬抗体水平开始显著升高,1号犬和4号犬在三周达最高滴度为1:400,其它各犬在第一周达最高滴度为1:200。各犬抗体逐渐下降持续至第7周,于第14周检测不到抗体。5中和试验测定免疫犬血清中和抗体水平攻毒前,除7号犬(中和抗体效价为1:8)其余各实验犬均未检测到中和抗体。在攻毒后,所有实验犬自第5天开始检测到中和抗体,1号犬较其它各实验犬抗体滴度高为1:128;1号、4号、5号和7号犬在第一周达最高滴度1:1024,其它各犬在第三周达其最高滴度,至第五周显著下降后逐渐下降至第27周。结论1本室构建的犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能够诱发Beagle犬产生较好的体液免疫应答反应。2本室构建的犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能够诱发Beagle犬产生中和抗体。

全文目录

中文摘要  4-9
英文摘要  9-16
研究论文犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫效果研究  16-48
  前言  16-18
  材料与方法  18-30
  结果  30-33
  附图  33-37
  附表  37-38
  讨论  38-42
  结论  42
  参考文献  42-48
综述  48-60
致谢  60-61
个人简历  61

犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫效果研究

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