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镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30和SP48基因的克隆及原核表达

作　者: 关洁
导　师: 周金林
学　校: 上海师范大学
专　业: 动物学
关键词: 镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶原核表达
分类号: S855.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蜱是一类仅依靠宿主血液生存的动物体表外寄生虫，蜱也因为传播大量的病原体而被人们熟知，包括立克次氏体、病毒、细菌、原虫等，这些病原体会导致动物和人类疾病。目前用来控蜱的策略仍然是用化学杀虫剂，但是这会带来蜱对杀虫剂的抗性，同时也会因为化学残留造成环境污染。因此，需要新的绿色环保的替代手段来控制蜱。不像其他的吸血节肢动物那样饱血迅速，蜱在吸附宿主后相当长一段时期吸取宿主大量的血液，因此蜱拥有一套有效地消化血液和吸收营养的机制。这些与蜱的吸血和血液消化相关的分子可能成为一类新的有效的控制蜱的疫苗候选分子，但是有关蜱消化血液的生物化学途径的信息很少。丝氨酸蛋白酶广泛存在于多种生物体中，参与众多的生理过程，如生理消化、血液凝固、免疫反应及细胞凋亡等。蜱吸食大量的血液之后，需要蜱体内的一系列酶来参与血液的消化，所以这些酶分子的分离及鉴定，不仅有助于了解蜱的生理学特征，还可以挖掘出有抗蜱免疫作用的候选靶标。本实验是采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)技术，从镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA中克隆出两个丝氨酸蛋白酶新基因，分别命名为SP30基因和SP48基因，进而对两个基因的全长序列进行生物学分析并进行编码序列的原核表达。应用Real-time PCR技术对两个基因在镰形扇头蜱的不同发育阶段和不同组织器官的差异表达分析，还对SP30和SP48基因进行了RNA干扰分析以及重组蛋白的酶活分析。结果表明，SP30和SP48基因全长分别为1194bp和1586bp，分别编码299aa和462aa，预测分子量大小分别为30kDa和48kDa，都具有信号肽。将两基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1上，进行原核表达，经IPTG诱导，得到大小分别为56kDa和74kDa的重组蛋白。用纯化得到的重组蛋白分别免疫小鼠制备抗血清，进行Western blot分析表明，两种抗血清均能够识别蜱肠道30kDa和48kDa的天然蛋白。Real-time PCR分析结果表明，SP30和SP48基因在蜱的不同发育阶段均有不同程度的表达，其中SP30基因在未吸血的若蜱阶段表达量最高，而SP48基因在半饱血的若蜱阶段表达量最高。SP30和SP48基因在蜱的不同组织器官也均有不同程度的表达，两者都是在蜱的肠道中表达量最高。酶活性分析表明，rSP48重组蛋白浓度为5μM时与底物反应，表现出一定的活性。Real-time PCR结果显示，SP30和SP48基因干扰前后沉默效果明显。从生物学特征来看，SP30和SP48基因在干扰后，饱血率发生了一定的变化。综上所述，本研究应用RACE技术克隆出SP30和SP48基因，并进行原核表达。应用Real-time PCR分析两基因在不同发育阶段及组织器官的差异表达，并对两基因进行了RNA干扰分析，这些研究将为蜱的生理学特性了解和研究抗蜱疫苗提供基础。

全文目录

Abstract  6-8
中文摘要  8-12
主要符号表  12-14
第一章引言  14-20
  1.1 蜱的简介  14-15
    1.1.1 蜱的生物特征  14
    1.1.2 蜱的危害及防治  14-15
  1.2 蛋白酶  15-19
    1.2.1 蛋白酶的特性  15-16
    1.2.2 丝氨酸蛋白酶家族  16-18
    1.2.3 丝氨酸蛋白酶的研究进展  18-19
  1.3 小结  19-20
第二章镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30 和SP48 基因的克隆  20-42
  2.1 前言  20
  2.2 材料  20-21
  2.3 方法  21-32
    2.3.1 cDNA的合成  21-22
    2.3.2 SP30 和SP48 基因保守区的克隆  22-25
    2.3.3 SP30 和SP48 基因 3'RACE的扩增  25-27
    2.3.4 SP30 和SP48 基因 5'RACE的扩增  27-31
    2.3.5 SP30 和SP48 基因全长的扩增  31-32
    2.3.6 SP30 和SP48 基因全长的分析  32
  2.4 结果  32-40
    2.4.1 镰形扇头蜱的饲养  32-33
    2.4.2 镰形扇头蜱总RNA的提取  33
    2.4.3 SP30 和SP48 基因保守区的扩增  33-34
    2.4.4 SP30 和SP48 基因 3'RACE端的扩增  34
    2.4.5 SP30 和SP48 基因 5'RACE端的扩增  34-35
    2.4.6 SP30 和SP48 基因全长的克隆和鉴定  35
    2.4.7 目的基因的生物学分析  35-40
  2.5 讨论  40-42
第三章 Real-time PCR分析SP30 和SP48 基因的表达特点及分布情况  42-48
  3.1 前言  42
  3.2 材料  42
  3.3 方法  42-45
    3.3.1 镰形扇头蜱各发育阶段蜱和蜱的各组织器官的收集  42-43
    3.3.2 Real-time PCR引物设计  43-44
    3.3.3 Real-time PCR分析  44-45
  3.4 结果  45-47
    3.4.1 Real-time PCR分析SP30 和SP48 基因在不同发育阶段的表达情况  45-46
    3.4.2 Real-time PCR分析SP30 和SP48 基因在不同组织器官的表达情况  46-47
  3.5 讨论  47-48
第四章镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30 和SP48 基因的原核表达  48-68
  4.1 前言  48
  4.2 材料  48-49
  4.3 方法  49-60
    4.3.1 原核表达载体的构建  49-52
    4.3.2 重组蛋白的表达  52-57
    4.3.3 抗血清的制备  57-58
    4.3.4 Western blot  58-60
    4.3.5 酶活分析  60
  4.4 结果  60-67
    4.4.1 原核表达载体的构建  60-65
    4.4.2 抗血清的制备  65-66
    4.4.3 Western blot分析  66-67
    4.4.4 酶活性分析  67
  4.5 讨论  67-68
第五章镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30 和SP48 基因的RNA干扰研究  68-76
  5.1 前言  68
  5.2 材料  68
  5.3 方法  68-73
    5.3.1 dsRNA的合成及纯化  68-71
    5.3.2 显微注射  71
    5.3.3 蜱的接种及饲养  71-72
    5.3.4 RNA干扰效果的分析  72-73
  5.4 结果  73-75
    5.4.1 Real-time PCR分析干扰效果  73-74
    5.4.2 RNA干扰对蜱的生物学性状的影响  74-75
  5.5 讨论  75-76
第六章全文总结  76-77
致谢  77-78
参考文献  78-82
附录  82-90
攻读学位期间取得的研究成果  90

镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30和SP48基因的克隆及原核表达

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