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本实验中研究的镰形扇头蜱是分布于我国南方的优势硬蜱种,是三宿主蜱,能够传播巴贝西虫。蜱在侵袭宿主过程中,面临多种障碍,其中血液凝集作用和宿主免疫反应最为重要,因此,蜱体会分泌多种活性分子,来抵抗血液的凝集,逃避宿主免疫作用,分离和鉴定此类分子,对研究抗蜱疫苗、研制新型抗凝血制剂、发现炎症抑制因子具有重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitors, Serpins)是一类结构相似、分布广泛、成员众多、功能多样的蛋白酶抑制剂家族,近年来相继从篦子硬蜱、肩胛硬蜱、具尾扇头蜱和长角硬蜱等蜱中分离得到Serpins基因,研究表明,Serpins具有抑制血液凝集、抵抗宿主免疫反应的功能,另外Serpins作为疫苗也具有一定程度的保护作用。镰形扇头蜱中Serpins的研究尚属空白,因此利用本实验室克隆得到的两条与Seprins同源性较高的表达序列标签(Express Sequence Taq, EST),采取RACE (Rapid Amplification of cDNA ends)方法从镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA中,克隆得到两条完整的基因序列,通过Blastn分析发现两基因都具有Serpins的典型结构,属于Serpins基因家族,命名为RHS1 (Rhipicephalus Haemaphysaloides Serpin-1)和RHS2(Rhipicephalus Haemaphysaloides Serpin-2),全长分别为1280bp和1682bp,最大开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)分别编码392aa和380aa,其中RHS1含有一段信号肽序列。将RHS1和RHS2编码序列亚克隆到pGEX-4T-1载体上,转入大肠BL21(DE3),加入IPTG诱导蛋白表达,预期蛋白大小均为43kDa,GST重组蛋白大小69kDa。RT-PCR结果表明,RHS1和RHS2在半饱血雌蜱唾液腺和肠道中均有表达,肠道中的基因丰度稍高。采用基因重组的方法,利用GST原核表达系统,成功表达和纯化出预期大小的Serpins蛋白,命名为rRHS1和rRHS2, Western blot结果表明兔抗镰形扇头蜱血清能够识别rRHS1和rRHS2,说明两种重组蛋白具有很好的免疫原性,因此,采用免疫小白鼠的方法,获得了anti-rRHS1和anti-rRHS2特异性抗血清。研究发现,anti-rRHS1和anti-rRHS2特异性抗血清,能够识别镰形扇头蜱半饱血雌蜱,其中RHS2蛋白主要在肠道中表达,其大小与预期大小一致,RHS1蛋白主要在肠道中表达,其大小与预期相差10kDa,表明RHS1蛋白在转录后的过程中存在较大的修饰。经体外酶抑制实验发现,两倍摩尔浓度重组蛋白能够显著抑制等的牛胰凝乳蛋白酶活性,rRHS1还能够部分抑制牛凝血蛋白酶活性。
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