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猪肌肉组织特异性诱导表达系统的构建和检测

作　者: 杨永兰
导　师: 蒋思文
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪组织特异性启动子 a-actin 诱导系统
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着转基因技术的发展,获得特异性强且无生物安全隐患的高效启动子成为研究热点。本实验以蜕皮素诱导系统为介导,在实验室前期已经分离获得的具有较高调控能力兼具肌肉组织特异性表达的a-actin启动子的基础上,将蜕皮素诱导系统调节质粒中可广谱表达外源基因的CMV启动子替换为猪肌肉特异性启动子a-actiin。构建猪肌肉特异性诱导表达系统,并在细胞水平上验证该肌肉特异性诱导系统在表达外源基因时是否兼备组织特异性和可调控性,为基因治疗和外源基因在骨骼肌组织的特异性表达提供实验依据。主要研究结果如下：1.将蜕皮素诱导表达系统调节质粒pVgRXR中的CMV启动子替换为猪肌肉特异性表达的a-actin启动子,选取绿色荧光蛋白EGFP为报告基因构建诱导系统中的反应质粒pIND-EGFP,用于检测双载体表达系统是否可以成功表达外源基因。研究结果表明,本研究构建的肌肉特异性诱导表达系统可启动外源基因的表达。2.将以上系统中的EGFP报告基因替换为p-半乳糖苷酶LacZ基因用于检测该系统的表达活性。实验结果显示该诱导系统报告基因表达量在一定的范围内均与诱导时间和诱导剂量呈正比例关系,分别在诱导时间为72h和诱导剂量在36μM时达到最大值,之后表达基本持平,并发现该系统在分化的C2C12细胞(即肌管)中的表达要极显著高于未分化的C2C12细胞(p<0.01),证明了该系统可在肌管中特异表达。3.利用p-半乳糖苷酶Lac2基因为报告基因,将该肌肉特异性诱导表达系统转染小鼠C2C12细胞,通过G418筛选,成功筛选出能稳定表达p-半乳糖苷酶基因的5株阳性单克隆细胞株,建立了可用于肌肉诱导表达的稳定细胞系,为下一步其它实验提供了基础。4.构建了以猪MyoD基因为外源基因的猪肌肉特异性诱导表达系统pVg-actin/pIND-MyoD,将该系统转染分化7天后的小鼠C2C12细胞,发现诱导剂浓度为36μM,诱导时间为48h的实验组中MyoD基因的表达量是未加诱导剂的对照组表达量的17倍,充分证明了该诱导系统表达外源基因的高效性。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
中英文縮写对照表  11-12
第一章文章综述  12-19
  1 前言  12-13
  2 组织特异性启动子  13-14
  3 骨骼肌特异性表达基因a-actin的研究进展  14-16
  4 蜕皮素诱导系统  16-17
  5 研究目的和意义  17-19
第二章材料和方法  19-44
  1 实验材料  19-25
    1.1 主要仪器和设备  19
    1.2 所用实验试剂  19-21
    1.3 所用载体和细胞  21-23
    1.4 常用试剂的配制  23-24
      1.4.1 细胞培养所用试剂的配制  23
      1.4.2 β-半乳糖苷酶活性检测所需试剂的配制  23-24
    1.5 主要生物学软件  24-25
  2 实验方法  25-44
    2.1 调节质粒pVg-actin载体的构建方案  25-32
      2.1.1 载体重组的引物设计  26-27
      2.1.2 PCR产物的检测、回收及纯化  27-28
      2.1.3 PCR产物的加尾及纯化  28
      2.1.4 PCR产物的克隆及测序  28-29
      2.1.5 T-actin和T-ZP的小量提取及酶切回收  29-30
      2.1.6 T-actin和T-ZP的酶切鉴定及片段的回收  30-31
      2.1.7 T-ZP-actin的小量提取及酶切回收  31
      2.1.8 pVg-actin的小量提取及酶切鉴定  31-32
    2.2 反应质粒pIND-LacZ和pIND-MyoD载体的构建  32-37
      2.2.1 重组质粒pIND-LacZ的小量提取及酶切鉴定  33-35
      2.2.2 MyoD基因片段的扩增  35-36
      2.2.3 pVg-actin以及pIND-MyoD可用于细胞转染的质粒小量提取  36-37
    2.3 C2C12细胞系培养  37-44
      2.3.1 冻存细胞的复苏  37
      2.3.2 细胞的培养和传代  37-38
      2.3.3 细胞的冻存  38
      2.3.4 C2C12细胞的诱导分化  38
      2.3.5 G418筛选C2C12细胞的预实验  38-39
      2.3.6 C2C12细胞的瞬时转染  39-40
      2.3.7 C2C12细胞的稳定筛选  40
      2.3.8 细胞总RNA的提取  40-41
      2.3.9 细胞总蛋白浓度测定  41
      2.3.10 β-半乳糖苷酶活性的检测  41-42
      2.3.11 β-半乳糖苷酶标准曲线的建立  42-43
      2.3.12 数据的处理及分析  43-44
第三章结果和分析  44-60
  1 猪肌肉特异性诱导表达系统的构建  44-54
    1.1 调节质粒pV-actin载体的构建  44-47
      1.1.1 猪α-actin启动子和ZP片段的获得  44-45
      1.1.2 T-actin及T-ZP的构建及酶切回收  45
      1.1.3 T-ZP-actin的构建及酶切回收  45-46
      1.1.4 pVg-actin的构建及酶切鉴定  46-47
    1.2 反应质粒pIND-EGFP/pIND-LacZ/pIND-MyoD载体的构建  47-51
      1.2.1 pIND-EGFP载体的构建和酶切鉴定  47-49
      1.2.2 pIND-LacZ载体的构建和酶切鉴定  49-50
      1.2.3 pIND-MyoD载体的构建和酶切鉴定  50-51
    1.3 C2C12细胞系的稳定筛选及诱导分化  51-54
      1.3.1 C2C12细胞的诱导分化  52
      1.3.2 细胞转染pVg-actin/pIND-EGFP质粒荧光检测  52-53
      1.3.3 阳性克隆细胞的检测  53-54
  2 β-半乳糖苷酶含量检测  54-58
    2.1 pVg-actin/pIND-LacZ系统中β-GaL表达量与诱导时间的关系  55-56
    2.2 pVg-actin/pIND-LacZ系统中β-GaL表达量与诱导浓度的关系  56-57
    2.3 不同时期肌管中β-GaL表达量与诱导浓度的关系  57
    2.4 小结  57-58
  3 pVg-actin/pIND-MyoD载体转染小鼠肌管在mRNA水平上的检测  58-60
第四章讨论  60-67
  1 β-半乳糖苷酶报告系统的作用  60
  2 组织特异性启动子  60-61
  3 真核表达载体的构建  61-62
  4 稳定转染细胞系的构建  62-63
  5 MyoD基因  63-64
  6 猪肌肉特异性诱导表达系统的功能验证  64-67
第五章结论  67-68
参考文献  68-74
附录  74-77
  附录1 α-actin启动子序列(268 bp)  74
  附录2 ZP上游序列(1620 bp)  74-75
  附录3 ZP-actin序列(1900 bp)  75
  附录4 MyoD序列(960 bp)  75-76
  附录5 EGFP序列(798bp)  76-77
致谢  77

猪肌肉组织特异性诱导表达系统的构建和检测

内容摘要

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