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miR-135a和miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的调控作用研究

作　者: 陈晨
导　师: 蒋思文
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 背部脂肪组织 Solexa测序 miR-135a miR-183 脂肪形成 启动子
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本论文旨在研究miRNA对脂肪细胞分化的影响,探讨miRNA调控脂肪细胞分化和脂肪形成的分子机制。我们以5月龄大白猪和梅山猪的背部脂肪组织为研究对象,分别构建背部脂肪组织的小RNA文库,应用高通量的Solexa测序技术和生物信息学分析软件鉴定大白猪和梅山猪背部脂肪组织的miRNAs,并进行差异表达和预测新的miRNAs等一系列分析。对这些差异表达的miRNAs进行了鉴定、靶基因预测和功能分析,从中筛选与脂肪细胞分化、脂肪形成和脂肪代谢潜在相关的miRNAs。预测分析结果发现miR-135a和miR-183可能通过调控经典的Wnt/β-catenin信号通路来影响脂肪的形成。据此,本研究通过合成寡核苷酸片段miRNA mimics和miRNA inhibitor分别模拟“功能获得”和“功能缺失”来研究miRNAs对3T3-L1脂肪细胞的甘油三酯含量和分化标记基因表达水平的影响,并通过双荧素酶报告基因检测、QPCR及Western blotting分析来证实预测的靶基因。最后,通过生物信息学软件对小鼠miR-183的侧翼序列进行预测、分离并克隆其核心启动子、ChiP-PCR试验证实GATA3是小鼠nir-183的转录因子,GATA3与mir-183核心启动子的结合可能负调控pri-miR-183的转录从而抑制成熟miR-183的表达。主要研究结果如下：1.猪背部脂肪组织miRNAs的筛选和鉴定Solexa高通量测序分析结果发现：①在大白猪和梅山猪的背部脂肪组织样品中分别获得21,911,830和22,384,940条小RNA原始序列,其中高质量序列各为19,510,268和19,952,323条,分别占小RNA序列的89.04%和89.13%。得到的纯净小RNA读数(clean reads)分别为19,271,999条(占高质量序列的98.78%)和19,613,350条(占高质量序列的98.30%)。②在两样品库中共鉴定出121个成熟miRNAs,包括72个已知的猪miRNAs和49个同源的猪中新的miRNA*.在9个差异表达显著的保守miRNAs, ssc-miR-135\ssc-miR-224、ssc-miR-146b和ssc-miR-215在大白猪中高表达,而ssc-miR-1a、ssc-miR-122、ssc-miR-133a、ssc-miR-183和ssc-miR-204则在梅山猪中高表达。③在两样品库中共发现了140个新的候选miRNAs(对应156个基因组位点),大白猪样品中87个,梅山猪样品中102个。其中miR-1343、miR-2320、miR-2326、miR-2411和miR-2483只与牛同源保守,其他都是猪特异的miRNAs。2.猪背部脂肪组织niRNAs的表达分析和功能预测对6个差异表达显著的保守miRNAs及4个新的候选miRNAs进行stem-loop QPCR试验验证。分析结果显示,除miR-la以外,其余miRNAs的表达趋势与Solexa测序结果一致。多种靶基因软件预测结果显示,小鼠的miR-135a与APC基因的3’UTR具有两个潜在的结合位点；GSK3β也可能是miR-135a的靶标；LRP6是miR-183的潜在靶基因。KEGG软件分析结果表明APC、GSK3fl和LRP6是经典Wnt/β-catenin信号通路中的重要成员。据此推测,miR-135a和miR-183有可能分别通过靶向作用APC、GSK3β和LRP6参与经典的Wnt/β-catenin信号通路来调控脂肪的形成。3.miR-135a对3T3-L1前脂肪细胞的分化及脂肪形成的影响与未分化的3T3-L1前脂肪细胞相比,成脂诱导分化过程中miR-135a的表达水平降低了约3倍。miR-135a处理组细胞的甘油三酯含量低于对照组,同时脂肪细胞分化标记基因(PPARγ、C/EBPa.ap2和FAS)的表达水平也降低。采用多种方法对预测的靶基因APC进行验证：与对照组相比,miR-135a显著抑制APC3’UTR载体的荧光活性(p<0.01)。miR-135a抑制3T3-L1细胞内源APCmRNA及蛋白质的表达水平。反之,抑制miR-135a的表达,3T3-L1细胞中的APC蛋白的表达量升高。miR-135a提高经典Wnt/β-catenin信号通路CCNDI和c-myc的mRNA及细胞核中β-catenin蛋白质的表达水平。因此,miR-135a通过靶向作用APC基因,激活经典的Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化和脂肪形成。4.miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中脂肪形成的影响诱导3T3-L1前脂肪细胞分化后的第2天和第4天,转染miR-183组的脂肪细胞分化标记基因(C/EBPa.PPARy.adiponectin和FAS)的mRNA表达量高于对照组。诱导5天的3T3-L1脂肪细胞的分析结果显示,miR-183组细胞较对照组的脂滴多、甘油三酯含量高(p<0.05)。另外,miR-183inhibitor抑制脂肪细胞分化标记基因PPARγ和C/EBPa的表达及甘油三酯的积累。对预测的靶基因LRP6进行验证：与对照相比,miR-183显著抑制LR尸63’UTR载体的荧光活性(p<0.01)。miR-183抑制3T3-L1细胞内源LRP6mRNA及蛋白质的表达水平。miR-183抑制经典Wnt/β-catenin信号通路c-myc的mRNA及细胞核中β-catenin的表达水平。因此,miR-183通过靶向结合LRP6,抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路的激活,从而促进脂肪形成。5.小鼠mir-183启动子的转录活性研究多种在线网站和软件对小鼠mir-183的预测结果表明,mir-183上游存在多个CpG岛、有可能的转录起始位点和众多的转录因子结合位点,miR-183侧翼序列存在多个EST数据报告。据此推测mir-183很有可能存在独立的转录单元。分两段扩增miR-183上游5kb的区域,即无CpG岛的promoter1及其上游含多个CpG岛的promoter2片段。结果表明,pGL3-mir-183promoter1无荧光活性,而pGL3-mir-183promoter2的荧光活性则极显著增强(p<0.01)。进一步分析结果显示promoter2片段5端的176bp区域能够极显著增强细胞荧光活性(p<0.01),其可能是]mir-183的核心启动子区域。TFSEARCH和TESS软件预测发现核心启动子中与脂肪形成相关的转录因子sp1和GATA3。试验结果表明,GATA3转录因子极显著降低核心启动子的荧光活性(p<0.01)。与正常核心启动子相比,GATA3结合位点突变的核心启动子活性显著增强(p<0.05)。另外,GATA3转录因子抑制成熟miR-183的表达量,ChIP-PCR试验证实转录因子GATA3与mir-183核心启动子的结合。以上试验结果表明转录因子GATA3与小鼠mir-183核心启动子的结合可能抑制pri-miR-183的转录,从而导致成熟miR-183的表达量下降。结论：①鉴定了更多的猪miRNAs,极大地丰富了猪的miRNA数据库；试验验证结果与Solexa测序结果基本一致,说明高通量Solexa测序方法的结果精确、真实可靠。②miR-135a通过直接靶向作用APC基因,促进细胞质中β-catenin蛋白的转位入核,激活经典的Wnt/β-catenin信号通路,抑制甘油三酯的积累和脂肪细胞分化标记基因的表达,从而阻碍3T3-L1前脂肪细胞的分化和脂肪形成。③miR-183通过靶向结合细胞表面受体基因LRP6,抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进脂肪细胞分化和甘油三酯的积累,从而促进3T3-L1前脂肪细胞的脂肪形成。④转录因子GATA3与小鼠mir-183核心启动子区的结合成熟miR-183的表达。

全文目录


摘要  9-12
ABSTRACT  12-16
中英文缩写对照表  16-17
第一章 文献综述  17-34
  1 引言  17
  2 脂肪形成概述  17-19
  3 WNT信号通路调控脂肪形成的研究进展  19-22
    3.1 WNT信号通路及信号转导  19-20
    3.2 WNT信号通路调控脂肪形成  20-22
  4 miRNA调控脂肪细胞分化的研究进展  22-31
    4.1 miRNA的发现、生物合成及作用机制  22-24
    4.2 miRNA参与调控脂肪细胞的分化过程  24-31
  5 miRNA调控WNT信号通路影响脂肪形成的研究进展  31-32
  6 miRNA的转录调控  32-33
  7 目的与意义  33-34
第二章 猪背部皮下脂肪组织小RNA文库的构建及Solexa测序  34-73
  前言  34
  1 材料与方法  34-39
    1.1 试验动物以及样品采集  34-35
    1.2 主要试剂和仪器  35
    1.3 组织总RNA的提取  35-36
    1.4 小RNA文库的构建、Solexa高通量测序及数据分析  36-39
      1.4.1 试验流程  36-37
      1.4.2 信息分析流程  37
      1.4.3 初级生物信息学分析  37
      1.4.4 高级生物信息学分析  37-39
  2 结果与分析  39-70
    2.1 总RNA样品的质量检测结果  39-40
    2.2 Solexa高通量测序结果的生物信息学分析  40-70
      2.2.1 大白猪和梅山猪小RNA库的测序结果数据统计  40-45
      2.2.2 小RNA的分类注释  45-48
      2.2.3 已知miRNAs的表达量分析  48-55
      2.2.4 miRNA“种子”序列的碱基编辑  55-59
      2.2.5 猪新的候选miRNA的鉴定分析和mirna基因的聚类分析  59-70
  3 讨论  70-72
  4 小结  72-73
第三章 猪背部皮下脂肪组织miRNA的表达分析及功能预测  73-85
  前言  73
  1 材料与方法  73-78
    1.1 试验动物以及样品采集  73
    1.2 主要试剂和仪器  73-74
    1.3 引物的设计与合成  74-76
    1.4 组织总RNA的提取  76
    1.5 RNA的反转录  76-77
      1.5.1 cDNA第一链的合成  76-77
      1.5.2 普通PCR反应  77
      1.5.3 琼脂糖凝胶电泳和成像  77
    1.6 Stem-loop QPCR验证  77-78
    1.7 统计学分析  78
    1.8 miRNA的靶基因预测及功能分析  78
  2 结果与分析  78-82
    2.1 普通PCR和stem-loop QPCR验证结果  78-80
    2.2 miRNA的靶基因预测及功能分析  80-82
  3 讨论  82-84
  4 小结  84-85
第四章 miR-135a和miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响  85-106
  前言  85
  1 材料与方法  85-92
    1.1 主要试剂和仪器  85
    1.2 主要溶液的配制  85-86
    1.3 miR-135a和miR-183寡核苷酸的转染及3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化  86-87
    1.4 细胞总RNA的提取  87
    1.5 QPCR分析  87-89
    1.6 油红O染色及吸光度值分析  89
    1.7 甘油三酯含量测定  89
    1.8 预测靶基因3'UTR载体及其突变载体的构建  89-92
    1.9 靶基因的鉴定  92
    1.10 经典WNT信号通路相关基因及蛋白质的检测  92
    1.11 Western blotting分析  92
    1.12 统计学分析  92
  2 结果与分析  92-103
    2.1 miR-135a对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响  92-97
      2.1.1 miR-135a在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中下调表达  92-93
      2.1.2 超表达miR-135a抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化  93-95
      2.1.3 miR-135a靶基因的鉴定及其潜在调控机制  95-97
    2.2 miR-183对3T3-L1前脂肪细胞分化及脂肪形成的影响  97-103
      2.2.1 miR-183促进3T3-L1前脂肪细胞的分化  97-101
      2.2.2 miR-183靶基因的鉴定及其潜在调控机制  101-103
  3 讨论  103-105
  4 小结  105-106
第五章 小鼠mir-183启动子的转录活性研究  106-122
  前言  106
  1 材料与方法  106-110
    1.1 主要试剂及仪器  106-109
    1.2 生物信息学分析  109
    1.3 启动子片段的扩增及载体构建  109
    1.4 细胞转染  109
    1.5 细胞总RNA的提取、反转录、QPCR及Western blotting分析  109
    1.6 ChIP-PCR验证转录因子GATA3与mir-183启动子的结合  109
    1.7 统计学分析  109-110
  2 结果与分析  110-119
    2.1 mmu-mir-183转录规律的预测  110-112
    2.2 mmu-mir-183启动子区域载体构建及荧光活性分析  112-114
    2.3 mmu-mir-183 promoter 2缺失片段载体构建及荧光活性分析  114-115
    2.4 mmu-mir-183核心启动子转录因子的结合预测及其试验验证  115-118
    2.5 转录因子GATA3对成熟miR-183表达量的影响及其机制研究  118-119
  3 讨论  119-121
  4 小结  121-122
主要创新点  122
进一步的研究内容  122-123
参考文献  123-138
在读期间发表论文题录  138-139
致谢  139

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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