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栉孔扇贝（Chlamys farreri）性别分化相关基因的筛选以及两个相关基因的表达分析

作　者: 秦贞奎
导　师: 张志峰
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 栉孔扇贝性别分化基因 Solexa测序核糖体蛋白L24基因卵黄蛋白原基因表达 17β-雌二醇
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

性别分化是发育生物学研究的重要内容之一,性别分化相关基因的研究在脊椎动物特别是哺乳动物中较为深入,目前已经发现了Sry、Sox9、Wnt4等诸多与性别决定和分化有关的基因;但在无脊椎动物特别是海洋贝类中相关的研究尚处于起步阶段。本研究选取我国重要的水产经济贝类——栉孔扇贝(Chlamys farreri)为研究对象,采用Solexa测序技术对其增殖期精卵巢的差异表达谱进行了分析,获得了295262个在精卵巢中差异表达的Tag,其中1354个Tag可以在GenBank数据库中得以注释。选择其中的5条核酸序列进行了半定量RT-PCR验证,发现solexa测序结果与半定量结果的一致率为40%。采用RACE技术对其中的CL3256序列进行全长cDNA扩增,序列比对初步判定其为核糖体蛋白24基因,定名为Cf-rlp24。该基因全长cDNA为965 bp,开放阅读框为525 bp,编码175个氨基酸,该推测蛋白在不同物种之间同源性很高。Real-time PCR检测Cf-rlp24基因在精、卵巢之间以及不同发育时期的精巢中均存在表达差异,其中生长期和成熟期精巢Cf-rlp24基因的表达量显著高于相应时期的卵巢,分别高出2.200±0.446倍和6.036±1.283倍;在精巢的发育过程中,该基因的表达呈逐渐升高的态势,至成熟期时达最高值,而后迅速回落;但在卵巢的发育过程中,始终处于较低的表达水平,且未见该基因的显著性表达差异。我们得出,Cf-rlp24基因参与栉孔扇贝性腺的发育,且在精巢发育中的作用大于卵巢。本研究我们还采用Real-time PCR技术,分析了栉孔扇贝卵黄蛋白原基因(Cf-vtg)在两性性腺发育周期以及肝胰腺中的表达,得出该基因主要在卵巢中表达,且其表达量随着卵巢的发育成熟而逐渐升高,生长期和成熟期Cf-vtg基因的表达量分别为增殖期的1.917±0.035和2.570±0.252倍。休止期卵巢该基因几乎没有表达。进一步我们发现Cf-vtg基因在肝胰腺中也有少量的表达,其表达量为增殖期卵巢中的0.045±0.009。该基因在精巢中几乎没有表达。进一步我们采用注射的方法,检测了17β-E2对扇贝Cf-vtg基因的诱导表达,real-time PCR结果显示,17β-E2可明显诱导Cf-vtg基因的表达。因此推测17β-E2可以促进栉孔扇贝扇贝Cf-VTG的合成。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章前言  11-25
  1 性别决定与性别分化机制  11-19
    1.1 脊椎动物的性别决定与分化机制  11-16
    1.2 无脊椎动物的性别决定与分化机制  16-17
    1.3 核糖体蛋白相关研究现状  17-18
    1.4 卵黄蛋白原相关研究现状  18-19
  2 DNA 测序技术  19-23
    2.1 第一代测序技术  20
    2.2 第二代测序技术  20-23
    2.3 高通量测序技术的发展趋势  23
  3 本研究的目的及意义  23-25
第二章栉孔扇贝性别分化相关基因筛选和初步验证  25-35
  1 材料与方法  25-30
    1.1 实验材料  25-26
    1.2 实验方法  26-30
  2 结果  30-33
    2.1 雌雄性腺总RNA 质量  30-31
    2.2 Solexa 测序结果  31-33
    2.3 RT-PCR 检测雌雄两性差异基因  33
  3 讨论  33-35
第三章栉孔扇贝核糖体蛋白 L24 基因的克隆及表达分析  35-47
  1 材料与方法  35-40
    1.1 实验材料  35
    1.2 实验方法  35-40
  2 结果  40-44
    2.1 Cf-rlp24 基因全长cDNA 序列的克隆  40-41
    2.2 Cf-rlp24 基因氨基酸序列比对及系统进化分析  41-43
    2.3 性腺发育周期中Cf-rlp24 基因的表达  43-44
  3 讨论  44-47
第四章栉孔扇贝卵黄蛋白原基因的表达分析  47-59
  1 材料与方法  47-52
    1.1 实验材料  47-48
    1.2 实验方法  48-52
  2 结果  52-56
    2.1 性腺发育周期中Cf-vtg 基因的表达  52-53
    2.2 卵巢及肝胰腺中Cf-vtg 基因的表达  53-54
    2.3 Cf-vtg 基因表达的原位杂交分析  54-56
    2.4 17β-E2 诱导后性腺中Cf-vtg 基因的表达  56
  3. 讨论  56-59
总结  59-60
参考文献  60-67
致谢  67-68
个人简历  68
发表的学术论文  68

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