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猪miRNA的分离、鉴定及其表达谱研究

作　者: 谢胜松
导　师: 赵书红
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 microRNA 克隆 Solexa测序软件预测表达谱
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

MicroRNA(miRNA)为一类大小约22个核苷酸的非编码小分子RNA,它们能通过与靶mRNA的3’UTR(untranslated region,非编码区)完全互补导致其降解,或不完全互补结合阻碍翻译。越来越多的证据表明miRNA在动物机体中起了重要的调节作用,然而,有关猪miRNA的研究报道较少。本研究分别构建了两个小分子RNA的cDNA文库并通过不同测序技术进行测序,进而结合生物信息学方法对猪miRNA进行深度挖掘,并检测了部分miRNA的组织表达谱,取得的主要结果如下:1.通过构建一个猪骨骼肌小分子RNA的cDNA文库,挑克隆测序,再通过生物信息学注释,发现了57个miRNA,其中39个还未见报道,有2个被认为是猪物种特异新miRNA,比较发现它们仅有一个碱基差别。通过克隆测序获得了这两个新miRNA的初级转录本部分序列,采用ClustalW程序进行两两比对发现它们的前体序列基本一致,但侧翼序列保守性较差,推测认为它们可能是在猪基因组进化过程中产生的重复基因。2.通过实时定量PCR技术检测了其中8个miRNA的组织表达谱,结果显示,ssc-let-7e和ssc-miR-181b在检测的8个组织中均有表达,但表达水平不一致。ssc-let-7c,ssc-miR-125b,ssc-miR-new1和ssc-miR-new2仅在其中一些组织表达,而ssc-miR-122和ssc-miR-206分别在猪肝脏和肌肉中特异表达。3.为了进一步系统全面地分离鉴定猪miRNA,我们构建了另外一个小分子RNA的cDNA文库并采用Solexa测序技术进行了测序。文库构建采用的组织有心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、胃、小肠、内脂、胸腺、肠系膜淋巴结、下颌淋巴结、睾丸、33d全胚、子宫内膜和胎盘,这些组织分别采自一头4月龄梅山公猪,1周龄杜洛克母猪,怀孕33d长白猪和大白母猪。通过Solexa测序,我们共获得了4821809条序列,去除污染和低质量序列并对重复序列计数,获得了大小为18～30nt的非冗余序列399963条,其测序数为3388980次,占总测序次数的70.28%。4.采用miRDeep程序和同源比对两种方法分别分析了Solexa测序数据,另外还采用了miRDeep程序预测了猪基因组中保守miRNA,对经由不同方法注释的结果整合发现共鉴定了460个猪保守和67个新miRNA,其中保守miRNA包含数据库收录的65个猪miRNA。比较发现鉴定的miRNA分别有269、194和164个与人、小鼠和大鼠相应miRNA序列完全一致。采用miRDeep程序对Solexa测序数据分析还发现了19个“miRNA样”新型小分子RNA,这些小分子RNA大小为27～30nt,其二级结构与miRNA前体特征完全一致。由同源比对法分析测序数据还发现了66个猪保守piwiRNAs(piRNAs)。对注释的miRNA序列分析发现其中存在大量单核苷酸多态(SNPs),这些新发现的侯选新型小分子RNA、piRNAs和SNPs需作进一步的实验验证。总之,通过构建两个小分子RNA的cDNA文库测序并结合生物信息学分析我们发现了大量miRNA,为下一步在猪中开展功能研究奠定了基础。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-13
第一章前言  13-22
  1 研究问题的由来  13
  2 文献综述  13-20
    2.1 miRNA的发现  13-15
    2.2 miRNA的生物合成和作用机制  15
    2.3 miRNA的表达调控  15-16
    2.4 miRNA实验鉴定和生物信息学预测  16-18
    2.5 miRNA表达检测  18-19
    2.6 猪中miRNA研究进展与不足  19-20
  3 研究目的和意义  20-22
第二章材料与方法  22-37
  1 材料  22-24
    1.1 组织样品  22
    1.2 分子生物学试剂及技术服务  22-23
    1.3 试剂的配制  23-24
    1.4 仪器设备  24
  2 方法  24-37
    2.1 猪骨骼肌miRNA的分离、鉴定及组织表达分析  24-34
      2.1.1 小分子RNA的cDNA文库构建和克隆测序  24-29
        2.1.1.1 寡核苷酸接头和引物合成  24
        2.1.1.2 提取总RNA  24-25
        2.1.1.3 分离并回收小分子RNA  25-26
        2.1.1.4 3'端加接头并纯化回收连接片段  26
        2.1.1.5 5'端加接头并纯化回收连接片段  26-27
        2.1.1.6 RT-PCR并纯化回收产物  27
        2.1.1.7 Ban Ⅰ酶切及片段的串连  27-28
        2.1.1.8 Taq DNA聚合酶温孵串连片段  28
        2.1.1.9 TA克隆并测序  28-29
      2.1.2 测序数据生物信息学分析  29-30
      2.1.3 miRNA的验证和组织表达谱分析  30-34
        2.1.3.1 Stem-loop RT-PCR测序验证  30-33
        2.1.3.2 miRNA组织表达定量检测  33-34
    2.2 采用Solexa高通量测序和生物信息学相结合的策略筛选miRNA  34-37
      2.2.1 小分子RNA的cDNA文库构建和Solexa高通量测序  34-35
        2.2.1.1 高质量总RNA的提取和检测  34
        2.2.1.2 文库构建和测序  34-35
      2.2.2 Solexa高通量测序数据分析  35-36
        2.2.2.1 miRDeep程序注释保守和新miRNA  35-36
        2.2.2.2 同源比对注释保守miRNA  36
      2.2.3 软件预测保守miRNA  36
      2.2.4 piRNA注释  36-37
第三章结果  37-73
  1 猪骨骼肌miRNA的分离、鉴定及表达分析  37-52
    1.1 小分子RNA分离和克隆测序  37-38
    1.2 注释的保守miRNA  38-43
    1.3 鉴定的猪特异新miRNA  43-46
    1.4 成熟miRNA的序列变异  46-49
    1.5 miRNA的基因组分布  49
    1.6 miRNA验证和组织表达谱  49-52
  2 采用Solexa高通量测序和生物信息学相结合的策略筛选miRNA  52-73
    2.1 总RNA质量检测  52
    2.2 测序序列长度分布  52-53
    2.3 miRDeep程序注释的miRNA  53-54
    2.4 同源比对注释的miRNA  54
    2.5 预测的保守miRNA  54-55
    2.6 不同策略注释的miRNA数据整合  55-69
    2.7 miRNA的序列变异  69-70
    2.8 注释序列特征  70-73
第四章讨论  73-79
  1 高质量RNA的制备是miRNA文库构建成功的关键  73-74
  2 对猪骨骼肌miRNA的分离、鉴定及组织表达分析结果的讨论  74-76
  3 对采用Solexa高通量测序和生物信息学相结合的策略筛选miRNA结果的讨论  76-79
    3.1 探讨由不同策略注释miRNA的优缺点  76-77
    3.2 与已报道miRNA比较  77-79
第五章小结  79-81
  1 本研究的主要结果  79
  2 本研究的创新点和特色  79-80
  3 本研究不足之处及进一步工作的建议  80-81
参考文献  81-87
附录  87-163
在读期间已发表或拟发表论文题录  163-164
致谢  164

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