学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪性成熟前后睾丸组织差异表达miRNA鉴定及功能分析

作　者: 罗立凡
导　师: 李凤娥
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 microRNAs(miRNAs) 睾丸 精子发生 靶基因 实时定量PCR 重组质粒 双荧光素酶报告系统
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 112次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


microRNAs (miRNAs)是一类18-22nt、内源性的、高度保守的非编码小分子RNA,它们广泛存在于真核生物基因组中。miRNAs在动物睾丸的发育成熟、各种细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要的作用。但目前关于miRNAs通过对关键基因的转录后调控来介导精子生成的遗传机制的报道却很有限,有关猪miRNAs基因功能以及与猪繁殖性状相关的miRNAs也鲜有研究。因而,猪睾丸组织miRNAs分离鉴定及功能研究,是一个值得探讨的新课题。本研究主要包括采用miRNAs芯片和实时定量PCR分离鉴定一批猪睾丸组织不同时期差异表达miRNAs、靶基因预测及靶基因表达谱分析、构建miRNAs超表达载体及构建双荧光素酶报告载体,取得如下研究结果：1. miRNAs芯片和实时定量PCR分离鉴定猪睾丸组织中差异表达miRNA选择大白猪60d、180d两个不同发育时期睾丸组织作为研究材料,合成miRNAs芯片(联川生物信息技术有限公司合成),检测到1260条成熟miRNAs序列,而164个探针代表129个miRNAs呈现差异表达(P<0.1),其中在性成熟阶段有51个miRNAs为上调表达,78个为下调表达。对总RNA进行加尾处理,应用qPCR的方法验证9个了差异表达的miRNAs,皮尔森相关系数均为0.5以上。2.靶基因预测及其在不同发育时期睾丸组织中的表达分析我们在NCBI数据库中随机检索得到445条猪基因cDNA序列,并对这445个基因进行了Gene ontology和KEGG通路分析,结果显示：在多组织过程、繁殖过程以及繁殖性状等多种生命过程中起重要的调节作用,并且在17个不同的通路中位于重要的位置。利用RNA22在线软件对上述129个miRNAs序列与445条猪基因cDNA序列分别进行结合位点预测,发现可能存在着15919个结合位点,其中位于基因CDS区域的结合位点占76.95%。对预测与睾丸发育及精子生成相关的7个潜在的靶基因在大白猪35d、60d、90d和180d四个不同时期睾丸组织进行表达分析。分析发现,精子粘附分子(AQN-1)和透明质酸合成酶3(HAS3)随着日龄的增长表达量逐渐增加,到性成熟却急剧下降,精原相关抗原1(SPAG1)的表达模式正好与之相反；精子线粒体相关富含半胱酸蛋白(SMCP)在性成熟后的表达量急剧增加；精子黏附分子(SPAM-1)的表达量随着日龄的增长而增长；DAZL的表达没有特定的规律；环指蛋白4(RNF4)在60d的表达量最高,之后随着日龄的增长其表达量逐渐下降。将生物信息学预测结果与qPCR结果进行比较,发现计算机预测的结果约有一半为假阳性。3. miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建扩增miR-762的初始转录本,构建miRNA表达载体,命名为pmiR-762,转染ST细胞,应用qPCR方法进行表达验证,结果表明其可用于miRNA功能的筛选和研究。扩增RNF4基因的3’-UTR,插入到pRL-TK以构建双荧光素酶报告载体,并与pmiR-762共转染ST细胞,应用双荧光素酶检测系统检测双荧光素酶相对活性,结果表明：miR-762与RNF4基因存在着一种负调控关系,并且miR-762对RNF4基因不同基因型的抑制效果具有差异。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章 文献综述  13-23
  1 前言  13
  2 miRNAs的发现及命名  13-14
    2.1 miRNAs的发现  13-14
    2.2 miRNAs的命名  14
  3 miRNAs的特点  14-15
    3.1 miRNAs的结构特点  14
    3.2 miRNAs的生物学特性  14-15
  4 miRNAs的形成及调控机制  15-17
    4.1 miRNAs的形成  15
    4.2 miRNAs的调控机制  15-17
  5 miRNAs的研究方法与检测技术  17-19
    5.1 正向遗传学筛选  17
    5.2 定向克隆  17-19
      5.2.1 组织特异性克隆  17-18
      5.2.2 miRNAs芯片  18
      5.2.3 Solexa测序  18-19
    5.3 生物信息学方法  19
  6 miRNAs在动物繁殖方面的研究现状  19-21
  7 猪miRNAs的研究现状  21
  8 目的与意义  21-23
第二章 材料与方法  23-34
  1 实验材料  23-26
    1.1 实验样品  23
      1.1.1 组织样品  23
      1.1.2 载体、菌株和细胞系  23
    1.2 主要仪器和设备  23-24
    1.3 主要试剂及试剂盒  24
    1.4 常用试剂及其配制  24-25
    1.5 主要生物信息学网站和分析软件  25-26
  2 试验方法  26-34
    2.1 miRNAs芯片合成  26
    2.2 总RNA的提取及反转录获得cDNA第一链  26-27
      2.2.1 猪睾丸组织总RNA的提取  26
      2.2.2 猪睾丸组织总RNA浓度的测定和质量检测  26-27
      2.2.3 cDNA的制备  27
      2.2.4 cDNA的检测  27
    2.3 差异表达miRNA的验证  27-30
      2.3.1 cDNA的制备  27-28
      2.3.2 miRNA成熟序列扩增引物设计  28
      2.3.3 miRNA成熟序列的扩增  28
      2.3.4 miRNA成熟序列的克隆鉴定  28
      2.3.5 实时定量PCR验证miRNAs芯片中的差异表达miRNA  28-29
      2.3.6 数据分析  29-30
    2.4 miRNA靶基因搜索  30-31
      2.4.1 靶基因实时定量PCR引物设计与合成  30-31
      2.4.2 靶基因的PCR扩增  31
      2.4.3 利用实时定量PCR对靶基因进行表达谱分析  31
      2.4.4 数据分析  31
    2.5 miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建  31-33
      2.5.1 插入片段的扩增  31-32
      2.5.2 载体的连接、测序及序列分析  32
      2.5.3 质粒的抽提及酶切鉴定  32-33
    2.6 细胞的培养  33
    2.7 miRNA表达载体转染猪睾丸细胞及转染后miRNA表达水平的检测  33
    2.8 双荧光素酶报告载体与miRNA表达载体共转染猪睾丸细胞  33
    2.9 双荧光素酶相对活性测定与分析  33-34
第三章 结果与分析  34-48
  1 猪睾丸组织总RNA的提取与质量检测及cDNA检测结果  34-35
    1.1 总RNA浓度测定  34
    1.2 总RNA质量检测结果  34
    1.3 cDNA检测结果  34-35
  2 猪睾丸组织总RNA加尾处理及加尾后cDNA检测结果  35-36
    2.1 加尾处理后RNA的质量检测结果  35
    2.2 加尾处理后cDNA检测结果  35-36
  3 miRNAs芯片筛选性成熟前后差异表达的miRNA  36-37
  4 差异表达miRNA的实时定量PCR验证  37-40
    4.1 PCR扩增结果  37
    4.2 实时定量PCR  37-40
  5 靶基因预测及其在睾丸组织不同发育时期的表达分析  40-45
    5.1 靶基因预测  40-43
    5.2 靶基因PCR扩增结果  43
    5.3 靶基因的实时定量PCR  43-45
  6 miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建与鉴定  45-48
    6.1 插入片段的PCR扩增  45
    6.2 重组质粒的酶切鉴定  45-46
    6.3 实时定量PCR检测转染后miRNA表达水平  46
    6.4 双荧光素酶活性检测  46-48
第四章 讨论  48-55
  1 关于差异表达miRNA  48-49
    1.1 关于miRNAs基因的预测方法  48
    1.2 关于差异表达miRNA的获得  48-49
  2 关于靶基因的预测  49
  3 关于本实验靶基因的验证  49-52
    3.1 关于AQN-1基因  50
    3.2 关于DAZL基因  50-51
    3.3 关于HAS3基因  51
    3.4 关于RNF4基因  51
    3.5 关于SMCP基因  51
    3.6 关于SPAG1基因  51-52
    3.7 关于SPAM-1基因  52
  4 关于实时定量PCR  52-53
  5 关于载体的构建  53
  6 关于miRNAs与靶基因相互作用关系的鉴定  53-54
  7 不足之处和下一步工作计划  54-55
小结  55-56
参考文献  56-63
致谢  63-64
附录  64-82

相似论文

  1. 猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素基因表达水平及其影响因素,R587.1
  2. 猪粪堆肥的理化特征及腐熟度评价研究,S141.4
  3. 猪BMP7基因启动子多态性及其与繁殖性状关联性分析,S828
  4. 猪BMP7基因外显子和内含子多态性检测及其与繁殖性状关系的研究,S828
  5. 猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究,S858.28
  6. 营养调控对猪生产性能及氮磷排放影响的研究,S828.5
  7. PRRSV的感染差异性和抗体依赖性增强作用研究,S858.28
  8. 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达,S858.28
  9. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  10. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  11. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白与猪血管内皮细胞互作蛋白筛选,S852.611
  12. 农业昆虫中微RNA基因的生物信息学预测,S186
  13. 小麦miRNA及花器官特异表达基因的鉴定与分析,S512.1
  14. 极端低蛋白日粮对初产小梅山母猪繁殖性能及其后代生长性能与免疫功能的影响,S828
  15. 副猪嗜血杆菌，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌2型三重PCR方法的建立与应用,S858.28
  16. 太湖猪卵巢组织FSHR基因表达水平与5’调控区多态性分析,S828
  17. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其在模拟体内发病条件下培养的蛋白组学研究,S858.28
  18. 多个猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体的分子生物学特征,S828
  19. 苏钟猪TLR4基因多态性及编码区C1027A功能分析,S828
  20. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞NF-κB信号的影响,S858.28
  21. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
© 2012 www.xueweilunwen.com