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骨形态发生蛋白6（BMP-6）在猪卵泡中的表达及功能研究

作　者: 李玉春
导　师: 倪华
学　校: 东北农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 骨形态发生蛋白6 猪卵母细胞颗粒细胞 StAR 3β-HSD
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

卵泡的形成和发育情况是影响雌性哺乳动物繁殖的一个重要方面。哺乳动物卵泡发育是一个十分复杂的过程,受到许多来自旁分泌、自分泌、邻分泌和内分泌因子以及信号通路的调控。近年来,已有报道表明BMP-6在啮齿类、反刍类及人类卵泡发育过程中发挥重要作用,猪作为一种重要的经济动物,目前关于BMP-6在猪卵泡中的研究还很少。利用Western Blot和免疫荧光技术在猪成熟卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中检测到BMP-6蛋白阳性信号,表明BMP-6在猪卵巢中表达并有可能影响卵泡发育。体外分离猪的卵母细胞,进行成熟培养,在培养过程中添加BMP-6蛋白,结果发现添加BMP-6蛋白的实验组与对照组相比,排出第一极体的卵母细胞数目显著增多,提示BMP-6能够促进猪卵母细胞的体外成熟。体外分离猪的颗粒细胞,添加不同浓度的BMP-6蛋白进行培养,实验结果显示外源添加的BMP-6蛋白能够促进颗粒细胞的体外增殖；收集不同浓度BMP-6培养的颗粒细胞,提取细胞总RNA和蛋白,用Real-time PCR和Western Blot分别在mRNA水平和蛋白水平检测孕酮合成过程中的两个关键蛋白——StAR和3β-HSD基因的表达情况,结果显示BMP-6以剂量依赖的方式抑制StAR和3β-HSD基因的表达,提示BMP-6能够抑制颗粒细胞孕酮的合成。推测BMP-6可能通过促进猪卵泡颗粒细胞的增殖和抑制颗粒细胞孕酮的合成,来抑制猪卵泡颗粒细胞的黄体化过程,抑制卵泡闭锁,维持卵泡的正常生理功能。猪不仅作为一种重要的经济动物,同时也是一种在转基因生物反应器领域有着广阔应用前景的理想模型动物,深入了解BMP-6基因对猪卵泡发育的调控机理,对于提高猪的生殖力,更合理有效地开发利用品种资源,加快优良品种的选育具有广阔的应用前景；同时为理解BMPs家族在卵巢的生理学和发育学中的作用提供理论基础,为卵母细胞的体外成熟提供更好的模拟环境,进而为科学研究和临床诊断治疗提供新的思路。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-26
  1.1 哺乳动物卵泡发育的研究进展  11-21
    1.1.1 哺乳动物原始卵泡的形成  12-13
    1.1.2 原始卵泡的维持及募集的启动  13-15
    1.1.3 腔前卵泡的发育  15-17
    1.1.4 卵泡膜的形成以及卵泡膜的生理学功能  17-19
    1.1.5 有腔卵泡的发育  19-20
    1.1.6 排卵及黄体化  20-21
  1.2 Bmp-6基因的研究进展  21-25
    1.2.1 BMPs家族概况  21
    1.2.2 Bmp-6基因的发现与结构  21-22
    1.2.3 BMP-6的信号调节  22-23
    1.2.4 BMP-6的生物学功能  23-25
  1.3 本研究的目的和意义  25-26
2 材料与方法  26-38
  2.1 免疫荧光  26-27
    2.1.1 载玻片的处理  26
    2.1.2 冰冻切片方法  26
    2.1.3 试剂及溶液  26-27
    2.1.4 免疫荧光流程  27
  2.2 猪卵泡颗粒细胞的体外培养及细胞处理  27-30
    2.2.1 猪卵泡颗粒细胞细胞的分离与体外培养  27-29
    2.2.2 MTT法检测卵泡颗粒细胞体外增殖  29
    2.2.3 细胞总蛋白的提取  29
    2.2.4 细胞总RNA的提取  29-30
  2.3 猪卵母细胞体外成熟培养  30-32
    2.3.1 主要仪器  30
    2.3.2 主要试剂  30-31
    2.3.3 猪卵母细胞的分离及体外成熟培养  31
    2.3.4 成熟卵母细胞的挑选  31-32
  2.4 Real-time RT-PCR  32-33
    2.4.1 引物序列  32
    2.4.2 总RNA的提取、消化与反转录  32-33
    2.4.3 Real time PCR反应  33
  2.5 Westerr blot  33-36
    2.5.1 相关溶液的制备  33-35
    2.5.2 蛋白样品制备  35
    2.5.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  35-36
    2.5.4 免疫印记和显影  36
  2.6 数据统计和分析  36-38
    2.6.1 卵母细胞体外成熟率的数据分析  36
    2.6.2 MTT法检测颗粒细胞体外增殖的数据分析  36-37
    2.6.3 Real-time RT-PCR数据分析  37-38
3 结果  38-49
  3.1 BMP-6蛋白在猪卵泡中的表达  38-39
    3.1.1 免疫荧光检测BMP-6在猪卵泡中的表达  38
    3.1.2 Western blot检测BMP-6在猪卵泡中的表达  38-39
  3.2 BMP-6重组蛋白对猪卵母细胞体外成熟的影响  39-40
  3.3 BMP-6重组蛋白对体外培养的猪卵泡颗粒细胞的影响  40-49
    3.3.1 猪卵泡颗粒细胞的培养  40-41
    3.3.2 MTT法检测外源的BMP-6对猪卵泡颗粒细胞体外增殖的影响  41-42
    3.3.3 Real-Time PCR检测孕酮合成相关基因的mRNA水平变化  42-47
    3.3.4 Western Blot检测孕酮合成相关基因的蛋白水平变化  47-49
4 讨论  49-53
  4.1 BMP-6在猪卵泡中的表达  49
  4.2 BMP-6与猪卵母细胞的成熟  49-50
  4.3 BMP-6对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响  50
  4.4 BMP-6对孕酮合成中的关键蛋白StAR和3β-HSD表达的影响  50-53
5 结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-64
攻读硕士期间发表的论文  64

骨形态发生蛋白6（BMP-6）在猪卵泡中的表达及功能研究

内容摘要

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