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茶树遗传转化体系的研究

作　者: 石冠华
导　师: 宛晓春
学　校: 安徽农业大学
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: 茶树遗传转化野葛愈伤抗氧化
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文构建了咖啡碱合成酶基因干涉表达载体，以茶树（Camellia sinensis cv.）龙井-43组培苗叶片为外植体，研究了影响根癌农杆菌介导的遗传转化体系因素。根据GUS染色情况，对影响农杆菌侵染茶树叶片效果的若干参数进行了优化，以期为低咖啡碱茶树品种培育提供一条新的途径。检测了野葛愈伤组织提取物清除自由基能力和抗氧化活性，为开发新型天然抗氧化剂提供了试验依据。1.咖啡碱合成酶（Tea caffeine synthase，TCS）基因RNAi载体的构建咖啡碱合成酶（TCS）是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶，故抑制TCS基因表达可以有效抑制茶树中咖啡碱的合成，是培育低咖啡因茶树的有效途径。以龙井-43组培苗叶片为材料，提取总RNA并反转录成cDNA。根据咖啡碱合成酶保守区设计简并引物，采用RT-PCR克隆到一350bp的cDNA序列。根据序列设计两对分别加有不同酶切位点的正、反基因的特异上下游引物，扩增出TCS保守区域的正、反义片断。将TCS反义片断、副球菌中类胡萝卜素合成有关的间隔基因YYT（GenBank withaccession number AY345165）以及TCS正义片断串联在一起，克隆到T载体。经测序鉴定后，双酶酶切下目标片断并插入到表达载体PCMBIA1301中，构建TCS基因的RNAi载体。2.茶树根癌农杆菌遗传转化体系的优化以茶树龙井-43组培苗叶片为转化受体，根据GUS表达情况优化了茶树根癌农杆菌法转化参数。结果表明，叶片预培养3d后用浓度OD600为0.8的菌液侵染10min，共培养4天，能够达到比较好的转化效果，15天后GUS表达率为63.3%。同时对龙井-43组培苗叶片进行了潮霉素敏感实验，筛选出茶树叶片农杆菌遗传转化中潮霉素的选择压浓度为40mg·L^-1。3.野葛愈伤组织提取物清除自由基活性采用l，l-二苯基苦基苯肼（DPPH·）的有机自由基体系以及羟自由基和超氧阴离子自由基两种无机活性氧自由基体系，以野葛根提取物作为对照，对野葛愈伤组织提取物的体外清除自由基和抗氧化活性进行了研究。实验发现：野葛愈伤组织提取物对DPPH·清除作用与野葛根提取物相当，而对羟自由基（·OH）的清除作用则弱于野葛根提取物。在浓度为0.2mg·mL^-1时，野葛愈伤组织提取物清除O2-·能力较强，显著优于野葛根提取物，而对邻苯三酚自氧化反应的抑制能力则与野葛根提取物相当。当浓度达到1.0mg·mL^-1时，野葛愈伤组织提取物清除O2-·的能力与野葛根提取物相当，而对邻苯三酚自氧化反应的抑制能力则显著强于野葛根提取物，是其抑制率的3.48倍。说明野葛愈伤组织提取物具有较强的清除自由基和抗氧化活性。通过HPLC法对两种器官提取物进行比较分析，发现其中的异黄酮组分及含量均不相同。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 文献综述  10-17
  1.1 茶树组织培养与物种改良  10-16
    1.1.1 茶树组织培养  10-12
    1.1.2 基因工程研究进展  12-13
    1.1.3 反义 RNA 技术的研究进展  13-14
    1.1.4 茶树遗传转化的研究进展  14-16
  1.2 野葛组织培养及其次生代谢产物  16-17
    1.2.1 野葛组织培养  16
    1.2.2 野葛次级代谢产物  16-17
2 引言  17-20
  2.1 研究目的与意义  17-18
  2.2 研究内容  18
  2.3 技术路线  18-20
3 咖啡碱合成酶（TCS）基因 RNAI 载体构建  20-30
  3.1 材料与方法  20-27
    3.1.1 材料  20
    3.1.2 菌株和载体  20
    3.1.3 试剂  20
    3.1.4 仪器设备  20
    3.1.5 茶树咖啡碱合成酶（TCS）基因 RNAI 载体构建  20-26
      3.1.5.1 培养基的配制  20-21
      3.1.5.2 试剂的配制  21
      3.1.5.3 茶树总RNA的提取  21-22
      3.1.5.4 咖啡碱合成酶（TCS）基因的反转录  22
      3.1.5.5 茶树咖啡碱合成酶（TCS）基因片段的 PCR 扩增  22-23
      3.1.5.6 PCR 产物的回收、克隆与测序  23-24
      3.1.5.7 构建干涉表达载体  24-26
    3.1.6 茶树咖啡碱合成酶（TCS）基因 RNAI 载体转化农杆菌  26-27
  3.2 结果分析  27-30
    3.2.1 茶树咖啡碱合成酶（TCS）基因干涉片段和 YYT 片段的 PCR 扩增  27
    3.2.2 茶树咖啡碱合成酶（TCS）基因干涉载体的构建  27-30
4 茶树遗传转化体系研究  30-40
  4.1 材料  30
    4.1.1 试验材料  30
    4.1.2 质粒与菌株  30
    4.1.3 主要试剂  30
    4.1.4 主要仪器  30
  4.2 方法  30-31
    4.2.1 茶树叶片对潮霉素的敏感性试验  30
    4.2.2 农杆菌介导的转化  30-31
    4.2.3 选择培养  31
  4.3 结果与分析  31-40
    4.3.1 潮霉素浓度对茶树叶片成活力的影响  31-32
    4.3.2 预培养时间对 GUS 表达率的影响  32-33
    4.3.3 菌液浓度和侵染时间对 GUS 表达率的影响  33-38
    4.3.4 共培养时间对 GUS 表达率的影响  38-40
5 野葛愈伤组织提取物体外清除自由基活性的研究  40-45
  5.1 材料  40
    5.1.1 试验材料  40
    5.1.2 仪器与试剂  40
  5.2 方法  40-42
    5.2.1 野葛愈伤组织的培养和继代  40
    5.2.2 野葛愈伤组织和野葛根样中总黄酮的提取  40
    5.2.3 野葛愈伤组织提取物对 1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH·）自由基清除作用的测定  40
    5.2.4 野葛愈伤组织提取物对羟自由基（·OH）清除作用的测定  40-41
    5.2.5 野葛愈伤组织提取物对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用的测定  41
    5.2.6 野葛愈伤组织和根提取物中异黄酮组分的 HPLC 分析  41-42
  5.3 结果与分析  42-45
    5.3.1 野葛愈伤组织提取物对 1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH·）自由基清除作用  42
    5.3.2 野葛愈伤组织提取物对羟自由基（·OH）清除作用  42
    5.3.3 野葛愈伤组织提取物对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用  42-43
    5.3.4 野葛愈伤组织和根提取物中异黄酮组分的比较分析  43-45
6 讨论  45-47
  6.1 构建咖啡碱合成酶 RNAI 载体  45
  6.2 优化茶树遗传转化体系  45-46
    6.2.1 影响茶树叶片遗传转化的因素  45-46
    6.2.2 叶片愈伤组织的形成以及植株的再生  46
  6.3 葛根愈伤组织提取物的抗氧化性  46-47
7 结论  47-48
参考文献  48-54
致谢  54-55
作者简介  55

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