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有机磷杀虫剂ScFv抗体库的构建与筛选

作　者: 寇立泉
导　师: 祁志军
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 农药学
关键词: 有机磷农药噬菌体展示技术单链抗体 ELISA
分类号: S482.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

有机磷杀虫剂（Ops）是一类重要的农业生产资料,在防治害虫和增加粮食产量方面发挥了极大的作用,但由于其大量使用带来的环境问题越来越受到人们的关注。传统的仪器检测样品前处理耗时长、操作水平要求高、操作仪器价格昂贵，难以实现大批量样品的快速筛选与现场的实时检测。噬菌体展示技术是继单克隆抗体制备技术后具有换代地位的抗体制备技术，因其筛选通量高、试验周期短、效率高、特异性强及亲和选择范围广等特点在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。本研究旨在建立一种利用基因工程单链抗体（ScFv）检测有机磷农药残留的方法，以便快速有效地检测食品中有机磷的含量。本研究在前人制备好的有机磷通用半抗原、人工抗原及免疫过的BALB/c小鼠的基础上，提取抗血清效价较高的小鼠脾脏总RNA，经RT-PCR分别扩增得到抗体重链可变区(V_H)基因和轻链可变区(V_L)基因，大小分别为340bp和325bp左右。经纯化回收后，V_H与V_L基因在等摩尔的浓度下，采用含有Linker接头片段的引物利用重叠延伸PCR法，将两段基因片段拼接起来，再用带有限制性内切酶位点的引物扩增出（单链可变区）ScFv基因，获得大小约750bp的目的片段。ScFv基因纯化回收后经SfiI和NotI双酶切，与同样经过双酶切的载体pCANTAB5E连接，采用热击法转化大肠杆菌TG1感受态细胞，提取质粒经PCR初步鉴定，证明有外源片段插入且与目的片段一致。转化菌经辅助噬菌体M13K07超感染后，在特定的筛选培养基中增殖，经过聚乙二醇沉淀，得到噬菌体抗体库。用多聚赖氨酸人工抗原作为包被抗原对得到的噬菌体抗体库进行洗脱，除掉非特异性识别的噬菌体后，感染对数期大肠杆菌TG1，经M13KO7超感染后，聚乙二醇沉淀，再次得到噬菌体抗体库。如此淘筛六轮，最终得到库容量为2.2×10~6pfu/mL的噬菌体抗体库。以HRP/anti-M13单克隆抗体作为酶标第二抗体进行间接ELISA筛选，以辅助噬菌体作为阴性对照筛选得到了一株可产生较高亲和力ScFv的噬菌体单链抗体株。利用获得的特异噬菌体侵染对数期大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导表达后，获得可溶性抗体。以HRP/Anti-E Tag为第二抗体进行间接ELISA检测，结果成阳性，说明表达可溶性抗体成功。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
第一章文献综述  10-28
  1.1 有机磷农药的理化性质  10
  1.2 有机磷农药的毒理作用  10-11
  1.3 有机磷农药的残留与危害  11
  1.4 农药残留传统检测方法  11-14
    1.4.1 波谱法  11
    1.4.2 色谱法  11-13
    1.4.3 酶抑制法  13-14
  1.5 新型免疫化学检测方法  14-21
    1.5.1 免疫分析  14-15
    1.5.2 免疫传感器  15
    1.5.3 免疫亲和色谱  15-16
    1.5.4 免疫标记  16-17
    1.5.5 抗体技术进展  17-21
  1.6 噬菌体展示技术  21-26
    1.6.1 噬菌体展示技术基本原理  21-22
    1.6.2 噬菌体展示系统类型  22-24
    1.6.3 噬菌体展示载体的构建  24
    1.6.4 噬菌体展示表达文库的筛选  24-25
    1.6.5 噬菌体展示技术应用举例  25-26
  1.7 问题的提出与研究内容  26-28
    1.7.1 问题的提出  26-27
    1.7.2 本文的研究内容  27-28
第二章 ScFv 基因的构建  28-34
  引言  28
  2.1 材料与方法  28-31
    2.1.1 试验材料  28
    2.1.2 主要仪器  28
    2.1.3 主要试剂  28
    2.1.4 小鼠脾脏总 RNA 的提取  28-29
    2.1.5 cDNA 第一链的合成及 V_L 和 V_H 的 PCR 扩增  29-30
    2.1.6 V_L和 V_H基因产物的回收与定量  30
    2.1.7 ScFv 基因的构建  30-31
  2.2 结果与分析  31-32
    2.2.1 脾脏总 RNA 提取结果  31
    2.2.2 V_L和 V_H的 PCR 扩增  31-32
    2.2.3 ScFv 基因的构建  32
  2.3 讨论  32-34
    2.3.1 脾脏总 RNA 的提取  32-33
    2.3.2 ScFv 基因的组装与扩增  33-34
第三章 ScFv 噬菌体抗体库的构建  34-43
  引言  34
  3.1 材料与方法  34-38
    3.1.1 菌株与质粒  34
    3.1.2 工具酶与抗体  34
    3.1.3 ScFv 基因和 pCANTAB 5E 的双酶切与连接转化  34-35
    3.1.4 E.coliTGI 感受态细胞的制备（氯化钙法）  35-36
    3.1.5 连接产物的转化及鉴定  36
    3.1.6 噬菌体抗体库的构建  36-37
    3.1.7 单链抗体的筛选  37
    3.1.8 可溶性抗体的获得  37-38
  3.2 结果与分析  38-41
    3.2.1 重组噬菌体质粒的 PCR 鉴定  38
    3.2.2 噬菌体库容的确定  38-39
    3.2.3 单链抗体特异性鉴定  39
    3.2.4 ELISA 检测呈阳性重组质粒的测序  39-40
    3.2.5 可溶性 ScFv 的检测  40-41
  3.3 讨论  41-43
    3.3.1 噬菌体展示技术库容的保证  41
    3.3.2 噬菌体单链抗体和可溶性抗体的表达  41-42
    3.3.3 噬菌体单链抗体和可溶性抗体的筛选  42-43
第四章结论  43-44
参考文献  44-48
附录  48-51
缩略词  51-52
致谢  52-53
作者简介  53

有机磷杀虫剂ScFv抗体库的构建与筛选

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