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桃流胶病菌BOTRYOSPHAERIAS SPP.鉴定、分布、遗传多样性及PCR快速检测技术研究

作　者: 王璠
导　师: 李国怀
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 桃流胶病 Botryosphaeria Fusicoccum aesculi Lasiodiplodia theobromae Diplodia seriata 分子系统学 形态学 致病性 多样性 PCR特异性检测 品种抗性
分类号: S436.621
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌是许多单子叶、双子叶和裸子植物上常见的病原菌、内生菌和腐生菌。能引起许多多年生木本植物产生溃疡、枯萎、坏死和流胶等症状。桃(Prunus persica L.)流胶病过去多认为是逆境和管理粗放等引起的生理性病害,而葡萄座腔菌属真菌在我国作为桃流胶病病原菌并没有进行系统的研究。桃流胶病主要为害枝干,造成主干、主枝等部位树皮产生胶状溢出物,树胶初期无色透明,随时间推移逐渐变成红褐色至深褐色。湖北省是我国重要的桃产区,流胶病发生严重,本研究从湖北省桃流胶病病原学入手,在分生孢子形态学、培养特性、分子系统学和致病性研究的基础上,对桃流胶病菌进行鉴定。同时,设计PCR特异性引物用于病原菌快速检测；对不同桃品种的抗病性进行评价等。主要结果如下：1.我国湖北省桃流胶病菌为Fusicoccum aesculi Corda, Diplodia seriata De Not.和Lasiodiplodia theobromae (Pat.) GrifF&Maubl.。Botryosphaeria spp作为桃流胶病菌最早是20世纪70年代在美国Georgia州报道的。到目前为止,我国报道的引起桃流胶病的该属真菌只有Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces.&De Not.。湖北省是我国桃生产的重要产区,流胶病发生普遍。为了解该省桃流胶病的发生情况,在咸宁市、武汉市、孝感市、随州市、远安县(宜昌市)等地调查了14个果园的1914棵桃树,总发病株率99.2%。从武汉市、咸宁市、孝感市、远安县(宜昌市)、随州市、老河口市(襄阳市)、沙洋县(荆门市)、公安县(荆州市)、枣阳市共采集桃流胶病枝条170份,获得116个Botryosphaeria spp分离株。结合菌落培养特性、分生孢子形态学、致病性测定和rDNA内转录间隔区(rDNAITS, ITS1-5.8S-ITS2)、β微管蛋白(p-tubulin)和α延伸因子(EF1-α)的分子系统学将湖北省桃流胶病菌鉴定为：F. aesculi(有性阶段B. dothidea)、D. seriata(有性阶段B. obtusa (Schwein.) Shoemaker)和L. theobromae(有性阶段B. rhodina (Cooke) Arx),其中F. aesculi分离频率最高,分布最广泛；L. theobromae仅在沙洋县发现；D. seriata在公安县有分布。人工菌丝块接种当年生新梢和多年生枝条结果表明,这三种真菌对桃树都有致病力,能产生褐色病斑；L. theobromae致病力最强,且能引起多年生枝条产生大量胶液；D. seriata致病力最弱。2.通过分生孢子形态学、致病力测定、分子系统学和微卫星分析证明了我国桃流胶病菌F. aesculi的遗传多样性。形态学研究表明,我国桃流胶病菌F. aesculi主要有两种类型的分生孢子,一种是典型的纺锤形至椭圆形、无色透明的无隔Fusicoccum属分生孢子；另一种是纺锤形的一分隔分生孢子,并不是很常见。致病力试验中,18个F. aesculi分离株接种曙光油桃新梢5d时,病斑长度差异显著,最长达40.1mm(菌株XNHG-241),最短仅5.8mm (XNHG-62)。ITS、β-tubulin和EF1-α3个基因的分子系统学分析进一步证明了F. aesculi是我国最常见的桃流胶病菌,分布范围最广,存在种内分化现象。利用微卫星引物M13, T3B和(CTC)4RC获得了DNA指纹图谱,0-1矩阵在SAS8.1软件中Cluster(聚类)和建树(Tree)分析表明我国桃流胶病菌F. aesculi可以分为7类。第一类包括FH-11, MYA-6, HB-14, XG-52, WX-12, XX-25, SHYJ-1, CDA-20, CD-13, HB-11, YLA-6, WX-10, XX-1, WX11-12, SH-15, XX-23, FY-24, FY17, XX-44, JZ-7, GA-323, TA-44, JM-5, WH-1252等24个菌株；第二类包括CH-11, FYY-1, ZJG-42, FH-10, WX-3, JMA-1112等6个菌株；第三类包括菌株WH-1822；第四类包括菌株TA-1；第五类包括菌株JM-20；第六类包括菌株CSJ-10；第七类包括菌株SH-5。3.设计了桃流胶病F. aesculi的特异性引物。在β-tubulin基因序列区域设计了一个正向引物FaF,与非特异性反向引物Bt2b组成引物对,特异性的扩增桃流胶病菌F. aesculi基因组DNA,得到一条大小为322bp条带。参与检测的20个F. aesculi都能扩增出该条带,其它两种桃流胶病菌L. theobromae和D. seriata及桃树和其它植物上的其它属真菌显示为阴性。引物对FaF/Bt2b的灵敏度为浓度1pg/μl的基因组DNA。同时利用裂解法快速提取F. aesculi DNA用于PCR检测。结果表明,建立的桃流胶病菌分子检测方法可用于该病菌的分子检测,快速确定病原菌,及侵染源数量和病害流行的预测。4.结合田间调查和室内接种方法评价了不同桃品种对流胶病的抗病性。修订了桃流胶病病害分级标准,重新评价了7个桃园中的4个桃品种的发病严重程度。结果表明,同一果园病情指数比用旧标准调查的更低,如华中农业大学花果山中砂子早生、曙光油桃和早露蟠三个品种用旧标准调查的病情指数分别为84.0、94、82.8,而修定后调查的病情指数分别为52.1、61.7、43.4,更好地反映了田间发病情况；同一果园不同品种发病严重程度不同,感病性强弱结果为：曙光(油桃)>砂子早生(普通桃)>早露蟠(蟠桃)。同时,采用F. aesculi (菌株XNHG-241)室内人工接种了21个桃品种,所有品种均能发病；比较接种5d时病斑长度,发现曙光油桃最感病,早凤王最耐病。其中感病性曙光油桃>砂子早生>早露蟠,与田间调查结果一致。

全文目录


摘要  9-12
Abstract  12-16
第一章 文献综述  16-32
  1 桃流胶病研究概况  16-23
    1.1 桃流胶病的发生及危害  16
    1.2 桃流胶病的病原学研究  16-19
      1.2.1 病原菌  16-17
      1.2.2 生物学特性  17-18
      1.2.3 致病机理  18-19
    1.3 病害循环及流行规律  19-22
      1.3.1 病原菌的侵染  19-20
      1.3.2 侵染时期及侵染途径  20-21
      1.3.3 流行规律  21-22
    1.4 桃种质资源对流胶病抗性  22-23
  2 葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)  23-28
    2.1 葡萄座腔菌属的分类地位(taxonomy)  23
    2.2 葡萄座腔菌属真菌的无性型  23-24
    2.3 分子系统学在葡萄座腔菌属真菌分类鉴定中的应用  24-26
    2.4 葡萄座腔菌属引起的植物病害  26-27
    2.5 Botryosphaeria spp.防治  27-28
  3 分子生物学技术在真菌鉴定和检测中的应用  28-31
    3.1 分子标记在真菌鉴定中的应用  28-29
    3.2 PCR特异性检测技术的应用  29-31
  4 本研究的目的与意义  31-32
第二章 湖北省桃流胶病病原鉴定  32-52
  1 材料与方法  32-41
    1.1 田间发病情况调查  32-33
      1.1.1 调查对象  32
      1.1.2 调查分析方法  32-33
    1.2 桃流胶病病样采集与病原菌分离纯化  33-34
      1.2.1 桃流胶病枝条采集  33
      1.2.2 分离与纯化  33-34
    1.3 致病性测定  34-36
      1.3.1 离体植物致病性测定  34
      1.3.2 田间植物致病性测定  34
      1.3.3 病原菌再分离  34-36
    1.4 病原菌形态学鉴定  36
      1.4.1 寄主上病菌形态观察  36
      1.4.2 PDA培养基上病菌形态观察  36
      1.4.3 形态学鉴定依据  36
    1.5 DNA序列分析和分子系统学  36-41
      1.5.1 基因组DNA提取  36-37
      1.5.2 PCR扩增引物  37
      1.5.3 PCR反应条件  37-38
      1.5.4 序列分析与分子系统学研究  38-41
    1.6 不同分离株致病力比较  41
    1.7 数据分析  41
  2 结果与分析  41-49
    2.1 田间发病情况调查结果  41
    2.2 病原菌分离  41
    2.3 致病性测定  41-42
      2.3.1 室内离体接种  41-42
      2.3.2 田间接种  42
    2.4 病原菌形态学鉴定  42-47
    2.5 DNA序列分析和分子系统学研究  47-48
    2.6 不同分离株的致病力比较  48-49
  3 讨论  49-52
第三章 我国桃流胶病菌Fusicoccum aesculi形态学、致病力和遗传多样性研究  52-70
  1 材料与方法  52-58
    1.1 供试菌株  52-55
    1.2 桃流胶病菌F. aesculi形态学  55-56
      1.2.1 产孢体和分生孢子诱导  55-56
      1.2.2 分生孢子形态学  56
    1.3 桃流胶病菌F aesculi致病力差异  56
      1.3.1 接种体准备  56
      1.3.2 接种材料  56
      1.3.3 接种方法  56
      1.3.4 致病力评价  56
    1.4 桃流胶病菌F. aesculi分子系统学研究  56-57
      1.4.1 多基因系统学的相关引物  56-57
      1.4.2 系统发育树构建  57
    1.5 微卫星分析  57-58
      1.5.1 DNA提取  57
      1.5.2 PCR引物  57
      1.5.3 PCR反应  57
      1.5.4 数据分析  57-58
  2 结果与分析  58-68
    2.1 桃流胶病菌Botryosphaeria spp.分布和形态学多样性  58-62
      2.1.1 分布  58-59
      2.1.2 Fusicoccum aesculi形态学多样性研究  59-62
    2.2 桃流胶病菌F. aesculi致病力多样性研究  62-63
    2.3 分子系统学分析  63-64
    2.4 微卫星分析  64-68
  3 讨论  68-70
第四章 桃流胶病菌Fusicoccum aesculi的PCR快速检测技术研究  70-77
  1 材料与方法  70-73
    1.1 供试菌株及培养条件  70-72
    1.2 基因组DNA提取  72
    1.3 引物设计  72
    1.4 引物特异性和灵敏度检测  72
    1.5 PCR反应体系  72-73
    1.6 桃流胶病样检测  73
  2 结果与分析  73-76
    2.1 引物设计  73-74
    2.2 引物特异性和灵敏度检测  74
    2.3 检测桃流胶病发病枝条中的F. aesculi  74-76
  3 讨论  76-77
第五章 不同桃品种对流胶病抗性评价  77-84
  1 材料与方法  77-80
    1.1 桃品种田间抗病性调查  77-78
      1.1.1 调查对象  77
      1.1.2 调查方法  77-78
    1.2 桃品种对流胶病抗性的室内鉴定  78-80
      1.2.1 接种体制备  78
      1.2.2 接种材料  78
      1.2.3 接种方法  78-79
      1.2.4 抗病性评价  79-80
  2 结果与分析  80-82
    2.1 桃树对流胶病田间抗病性调查  80
    2.2 桃品种对流胶病抗性的室内鉴定  80-82
  3 讨论  82-84
第六章 结论、创新点与展望  84-87
  1 结论  84-85
  2 创新点  85
  3 展望  85-87
参考文献  87-101
致谢  101-102
攻读博士期间发表的学术论文  102

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