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中国北方棉区棉花立枯病菌融合群鉴定及优势融合群的特异性检测

作　者: 井岩
导　师: 于金凤
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 棉花立枯病融合群 5.8S rDNA-ITS ISSR-PCR 特异性检测
分类号: S435.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

棉花立枯病是棉花苗期重要的土传真菌病害之一,该病害在棉花苗期发生普遍,尤其是重茬棉田,发病率高达50%-60%,直接影响棉花的密植匀株,间接诱发中后期病害及铃病的发生,严重影响棉花的产量和品质。我国是世界上的产棉大国,2004-2008年间棉花均产量达678.14万吨,占世界原棉年均总产量的27.91%,如何有效的防治棉花立枯病害具有重要意义。以山东、河北和河南为代表的北方棉区是我国棉花主产区之一,常年种植面积和总产量均占全国的25%以上,棉花立枯病对该地区棉花的危害比较严重,本研究对该地区棉花立枯病菌的融合群类群进行了系统鉴定并对其优势融合类群AG4-HG-Ⅰ进行了特异性检测,主要研究结果如下：1.从山东、河北和河南三省采集棉花立枯病标本和土壤各100余份,使用带菌土壤温室中种植棉苗诱发病菌,从诱导发病的植株上再分离病菌,以此作为对一些田间标本采集量不足的补充。对采集到的棉花立枯病病株采用常规组织分离方法进行分离,获得198个丝核菌分离物。融合群测定结果表明,这些菌株分别属于多核丝核菌的AG4-HG-Ⅰ、 AG4-HG-Ⅲ融合群以及双核丝核菌的AG-A、AG-F、AG-Fb融合群。其中AG4-HG-Ⅰ是优势融合类群,占分离菌株总数的88.38%,其次是AG4-HG-Ⅲ群,占10.10%,AG-A、 AG-F、AG-Fb各仅有1株。双核丝核菌AG-A、AG-F和AG-Fb融合群是国内首次从棉花植株上分离获得。2.菌株的核相观察显示：双核类的丝核菌细胞核均为2个；多核类的在3个以上。AG4-HG-Ⅰ和AG4-HG-Ⅲ虽然都属于多核类的AG-4融合群,但是两个不同亚群的细胞核数目存在较大差异：AG4-HG-Ⅰ亚群菌株细胞核数目在6-10个之间,AG4-HG-Ⅲ亚群菌株细胞核数目在3-5个之间。3.利用5.8S rDNA-ITS区序列分析方法,对该地区棉花立枯病菌不同融合群代表菌株的系统演化关系进行了研究。结果表明,相同融合群(或亚群)的菌株,序列一致率达98-100%,而不同融合群(或亚群)菌株之间差异较大。说明此基因序列可以对丝核菌不同融合群或亚群的菌株进行有效区分和鉴定。依据本研究测得的16个代表菌株及13个源自GenBank且隶属不同融合群的菌株序列所构建的系统发育树可以看出,所有供试菌株被分成三个大组。第一组为多核类丝核菌,包括AG-4融合群的两个亚群即AG4-HG-Ⅰ和AG4-HG-Ⅲ,这两个亚群在进化上关系较近；第二组为两个双核类丝核菌群,为AG-F和AG-Fb两个融合群；第三组为双核类的AG-A融合群。进一步分析各融合群间的进化关系可以看出,双核类的AG-F和AG-Fb两个融合亚群与多核类的AG-4融合群亲缘关系相近,而同属于双核丝核菌的AG-A与AG-4融合群的进化关系相对较远。4.采用麦粒-土壤接种法对棉花立枯病菌的优势融合类群AG4-HG-I菌株以及分离得到的双核丝核菌进行致病性测定。结果表明,所有的AG4-HG-I群菌株均有较强的致病性,平均病情指数为55-100,三个双核丝核菌对棉花幼苗的平均病情指数为12.77。5.用三个双核丝核菌针对棉花立枯病优势致病群AG4-HG-I进行生防效果测定,用DPS软件对病情指数进行student t值检验。结果表明：三个双核丝核菌菌株对棉花立枯丝核菌AG4-HG-I融合群菌株的生防效果不明显。6.利用35个ISSR引物对来自不同寄主上的AG4-HG-I融合群菌株(8个),以及12个其他融合群菌株进行ISSR分析。从中选取出8个能对AG4-HG-I群菌株扩增出特异性条带的引物,利用这些引物对各融合群代表性菌株进行ISSR-PCR扩增,将仅对AG4-HG-I融合群特异的片段进行胶回收、测序,并根据测序结果设计出针对AG4-HG-I的特异性引物对。7.用所合成的引物进行特异性检测结果表明,引物对J6-S和J6-A能针对AG4-HG-I群菌株扩增出特异性片段,所扩增的片段大小为363bp,属于其他融合群的丝核菌菌株没有扩增到任何片段；利用设计的引物分别检测用AG4-HG-I融合群菌株接种的土壤、采自连作棉田的土壤、采自麦田的土壤、灭菌土壤,一次PCR仅在AG4-HG-I融合群菌株接种的土壤中能检测到该特异性条带,其它土壤中没有检测到该特异性条带；采用二次PCR在棉田土壤中也能够扩增出该特异性条带,灭菌的土壤中没有得到此特异性条带,说明此引物对棉田连作土壤中的AG4-HG-I群菌株能进行检测,但检测的灵敏度有待进一步改善和提高。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-14
1 引言  14-33
  1.1 棉花立枯病的研究概况  14-18
    1.1.1 棉花立枯病的发病规律  14-15
      1.1.1.1 症状  14
      1.1.1.2 病害循环  14-15
      1.1.1.3 发病条件  15
    1.1.2 病原  15-17
    1.1.3 病害防治  17-18
  1.2 立枯丝核菌的分类概况  18-24
    1.2.1 分类特征  18
    1.2.2 国际分类框架  18-19
    1.2.3 菌丝融合群分类法在丝核菌上的应用  19-24
      1.2.3.1 多核丝核菌及融合群划分  19-22
      1.2.3.2 双核丝核菌及融合群划分  22-24
  1.3 分子生物学技术在立枯丝核菌遗传多样性研究中的应用  24-27
    1.3.1 血清学技术和GC含量  24
    1.3.2 DNA分子标记技术的应用  24-27
      1.3.2.1 Southern杂交技术和DNA的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)  24-25
      1.3.2.2 RAPD用于融合群的划分  25
      1.3.2.3 扩增片段长度多态性(AFLP)  25-26
      1.3.2.4 简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)  26-27
      1.3.2.5 同工酶分析方法  27
      1.3.2.6 ISSR标记技术  27
  1.4 核糖体DNA在丝核菌系统演化研究中的意义及作用  27-30
    1.4.1 真菌rDNA特异性扩增的通用引物  28
    1.4.2 rDNA序列分析在丝核菌系统演化研究中的应用  28-30
  1.5 特异性引物对的合成  30-31
  1.6 本研究的目的意义  31-33
2 材料方法  33-45
  2.1 棉花立枯病标本的采集及菌株的分离与鉴定  33
    2.1.1 田间病株采集  33
    2.1.2 病田土壤诱发  33
    2.1.3 病原物的分离纯化  33
  2.2 菌株的培养性状及核相观察  33
  2.3 菌丝融合群测定  33-34
  2.4 供试菌株DNA的提取  34-35
    2.4.1 提取试剂  34
    2.4.2 所用仪器  34-35
    2.4.3 DNA提取步骤  35
  2.5 棉花立枯病菌的5.8S rDNA-ITS区序列分析  35-37
    2.5.1 供试菌株及试剂  35-36
    2.5.2 PCR扩增  36-37
    2.5.3 特异性扩增片段的回收  37
    2.5.4 回收产物检测  37
  2.6 特异扩增片段的克隆  37-38
    2.6.1 克隆反应体系的建立  37-38
    2.6.2 转化  38
    2.6.3 单克隆检测  38
  2.7 序列测定及分析  38
  2.8 优势融合群AG4-HG-I菌株及双核丝核菌菌株的致病性测定  38-39
    2.8.1 麦粒培养基的配制  38
    2.8.2 棉花种子的处理筛选  38-39
    2.8.3 温室接种测定致病性  39
  2.9 双核丝核菌的生防效果测定  39
  2.10 AG4-HG-I融合群的ISSR体系的建立及遗传多样性分析  39-45
    2.10.1 供试菌株与引物  39-41
    2.10.2 ISSR反应体系的优化  41-42
    2.10.3 引物筛选  42
    2.10.4 特异性引物的合成  42
      2.10.4.1 引物设计区段的确定  42
      2.10.4.2 引物设计  42
    2.10.5 特异性引物的验证  42-45
      2.10.5.1 利用各融合群菌株DNA的验证  43
      2.10.5.2 从土壤中提取DNA验证该特异性引物  43-44
      2.10.5.3 PCR扩增检测  44-45
3 结果与分析  45-65
  3.1 北方地区棉花立枯病菌的融合群构成  45-51
  3.2 病原菌的培养性状及核相观察  51-53
    3.2.1 培养性状观察  51-52
    3.2.2 菌株的核相观察  52-53
  3.3 棉花立枯病菌的5.8S rDNA-ITS区序列分析  53-55
    3.3.1 PCR扩增结果  53
    3.3.2 棉花立枯病菌不同融合群菌株的5.8S rDNA-ITS区序列分析  53-55
  3.4 棉花立枯病菌不同融合群菌株的系统发育关系分析  55
  3.5 优势融合群AG4-HG-I菌株及双核丝核菌的致病性测定  55
  3.6 双核丝核菌的生防效果测定  55-57
  3.7 AG4-HG-I融合群的ISSR分析及特异性引物的合成  57-65
    3.7.1 ISSR反应体系的建立和优化  57-58
    3.7.2 引物筛选  58-59
    3.7.3 特异性引物的合成  59-62
    3.7.4 特异性引物的检测  62-65
      3.7.4.1 引物对AG4-HG-I及其他融合群菌株的特异性扩增  62
      3.7.4.2 引物对土壤真菌DNA的特异性扩增  62-64
      3.7.4.3 特异性引物对的灵敏度检测  64-65
4 讨论  65-69
  4.1 关于从土壤中分离丝核菌的方法问题  65
  4.2 关于北方棉区棉花立枯病的融合群组成  65-66
  4.3 关于立枯丝核菌的核相  66
  4.4 关于优势融合群AG4-HG-I的致病性  66-67
  4.5 关于双核丝核菌的生防效果  67
  4.6 关于特异性引物的合成  67-69
5 结论  69-70
参考文献  70-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表论文情况  81

中国北方棉区棉花立枯病菌融合群鉴定及优势融合群的特异性检测

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