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啤酒花矮化类病毒寄主适应性和致病性研究

作　者: 张志想
导　师: 李世访; 佐野辉男
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 啤酒花矮化类病毒遗传多样性复制能力致病性 sRNA
分类号: S432.41
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)是啤酒花矮化类病毒属(Hostnviroid)的唯一成员，其寄主范围广泛，能够侵染葡萄、啤酒花和核果类果树并引起一些严重危害作物生产的病害如：啤酒花矮化病，桃、李斑果病等。虽然从2006年开始，已经有HSVd在我国杏、桃和葡萄等不同寄主上发生的零星报道，但是对HSVd的发生、分布、遗传变异、传播规律、寄主适应性和致病性变化等问题尚未进行系统的研究。因此，本研究旨在系统解答上述问题。首先，构建了多聚探针，建立了使用斑点杂交同时检测4种侵染葡萄的类病毒：HSVd、澳大利亚葡萄类病毒(Australian grapevine viroid, AGVd)、葡萄黄痘类病毒1和2(Grapevine yellowspeckle viroid-1and2, GYSVd-1and2)的技术体系。通过亚克隆的方法将这4种类病毒的全长cDNA顺次连接到同一个载体上构建出重组质粒后，体外转录出多聚cRNA探针。该探针与单一类病毒的探针具有相似的检测灵敏度。此外，还将CTAB法提取葡萄RNA的方法应用于多聚探针的检测，从而建立了一种快速、灵敏且低成本的葡萄类病毒检测技术体系。该体系可以被广泛应用于植物检验、检疫和脱毒材料的筛选等方面。其次，应用建立的快速检测技术体系并且结合斑点杂交检测调查了HSVd在中国的发生、分布；使用RT-PCR、克隆和测序的方法分析了HSVd中国分离物的遗传变异。从17省市共采集了553个样品，在来自于6种寄主(葡萄、啤酒花、桃、李、杏、巴旦杏)上的127个样品中检测到了HSVd，平均感染率为23%。序列分析发现：1)从采自不同地区，不同寄主的样品上可以获得序列完全一致的变体，表明不同寄主间可能存在交叉传播。2)中国HSVd的葡萄、啤酒花和核果类分离物主要属于Hop组和Plum组，但是，分离于葡萄的两个变体HSVd.apr50和HSVd.apr57不能被划入任何一个已知的组内，而是和HSVd.apr35形成一个新的由已知的组通过重组形成的组。3) HSVd.g38是目前为止已知的唯一一个被划分到Plum组的从葡萄中分离出的变体。这不仅表明了葡萄分离物的明显异质性，而且暗示了HSVd在葡萄和核果类果树间可能也存在交叉传播。最后，构建了HSVd的葡萄株系KY04及其在啤酒花上经过适应进化后而产生的新株系KFKi的侵染性克隆。通过单独和混合接种葡萄、啤酒花和黄瓜，比较了这两个株系的侵染性、致病性和复制能力。发现：1)变体KFKi不能够在葡萄中稳定复制，而是回复突变为KY04。表明HSVd的适应性进化具有寄主的特异性。2)无论在啤酒花还是在黄瓜上，KFKi的侵染性、复制能力和致病性均低于KY04，这说明侵染性、复制能力和致病性的降低并不影响KFKi生存优势的增强。暗示HSVd在进化中遵循“trade-off”的原则。3)在热变性过程中，KFKi的二级结构的稳定性低于KY04。4) KY04侵染啤酒花后产生的sRNA的量明显多于KFKi。这说明HSVd在适应性进化前受到的来自于寄主基因沉默作用的选择压力大于进化后变体所受到的选择压力。为拮抗基因沉默介导的寄主防卫反应，类病毒在长期的进化中演变出了严紧的二级结构。我们的研究为这一假设提供了具体的证据。5) HSVd-sRNA在基因组上呈现不均衡分布，且基因组上存在一些特定的产生sRNA的热点区域。比较发现：同一种类病毒在不同寄主上所产生的sRNA在基因组上的分布并不相同。这表明类病毒sRNA的产生受寄主的影响。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章绪论  13-36
  1.1 类病毒概述  13-19
    1.1.1 类病毒的发现及分类  13-15
    1.1.2 类病毒的生物学特征  15-19
  1.2 类病毒的结构  19-21
  1.3 类病毒的复制  21-26
    1.3.1 类病毒的亚细胞定位  22
    1.3.2 RNA 转录  22-25
    1.3.3 剪切和连接  25-26
  1.4 类病毒的移动和运输  26-28
    1.4.1 细胞与细胞间的转运  27
    1.4.2 长距离运输  27-28
  1.5 类病毒的致病机制  28-32
    1.5.1 类病毒与寄主因子的相互作用  28-31
    1.5.2 RNA 沉默与类病毒致病性  31
    1.5.3 类病毒的侵染对寄主特定基因的表达的影响  31-32
  1.6 类病毒的遗传与进化  32
    1.6.1 种群形成机制  32
    1.6.2 遗传多样性与寄主的适应性  32
  1.7 类病毒研究的基础生物学意义  32-33
  1.8 本研究的目的、意义及技术路线  33-36
    1.8.1 本研究的目的和意义  33-34
    1.8.2 研究内容和技术路线  34-36
第二章多聚探针同时检测 4 种侵染葡萄的类病毒  36-46
  2.1 前言  36-37
  2.2 实验材料  37-38
    2.2.1 材料的采集  37
    2.2.2 试剂及溶液配制  37-38
    2.2.3 主要仪器  38
  2.3 实验方法  38-40
    2.3.1 总 RNA 提取  38
    2.3.2 RT-PCR，克隆和测序  38-39
    2.3.3 单个类病毒的探针和多聚探针 (Polyprobe) 的制备  39-40
    2.3.4 斑点杂交 (Dot-blot hybridization)  40
  2.4 结果  40-44
    2.4.1 提取的葡萄总 RNA 的质量  40
    2.4.2 多聚探针检测的特异性和灵敏度测定  40-41
    2.4.3 使用多聚探针检测田间葡萄样品  41-42
    2.4.4 葡萄类病毒田间发生分布的调查  42-44
  2.5 讨论  44-46
第三章 HSVd 发生和分布的调查及遗传进化分析  46-68
  3.1 前言  46
  3.2 实验材料  46-49
    3.2.1 样品采集  46-47
    3.2.2 试剂及溶液配制  47-49
    3.2.3 主要仪器  49
  3.3 实验方法  49-53
    3.3.1 低分子量 RNA 的提取及浓度测定  49
    3.3.2 HSVd-cRNA 探针制备及斑点杂交 (dot-blot hybridization)  49-51
    3.3.3 RT-PCR、克隆和测序  51-53
    3.3.4 序列分析及 HSVd 二级结构预测  53
    3.3.5 系统发育分析  53
  3.4 结果与分析  53-64
    3.4.1 发生和分布  53
    3.4.2 多序列比对  53-55
    3.4.3 系统发育分析  55-62
    3.4.4 重组分析  62-63
    3.4.5 突变位点及信息位点的分析  63-64
  3.5 讨论  64-68
    3.5.1 HSVd 在不同寄主间的交叉传播  64-66
    3.5.2 重组和突变是 HSVd 进化的动力  66
    3.5.3 HSVd 复制相关的 Hairpin I 和 Loop E-like 结构基序  66-68
第四章 HSVd-KY04 及 HSVd-KFKi 的寄主适应性和致病性研究  68-91
  4.1 前言  68
  4.2 实验材料  68-70
    4.2.1 接种植株和接种物  68-69
    4.2.2 试剂及常用溶液配制  69-70
    4.2.3 主要仪器  70
  4.3 实验方法  70-74
    4.3.1 侵染性克隆的构建  70-72
    4.3.2 RNA 的提取  72
    4.3.3 小 RNA 的分离与纯化  72
    4.3.4 核酸分子杂交检测  72-73
    4.3.5 HSVd 的克隆及测序  73-74
    4.3.6 高通量测序及分析  74
  4.4 结果  74-89
    4.4.1 HSVd-KY04 和 KFKi 的侵染性和复制稳定性  74-77
    4.4.2 HSVd-KY04 和 KFKi 的致病性  77-78
    4.4.3 HSVd-KY04 和 KFKi 的复制能力  78-79
    4.4.4 HSVd-KY04 和 KFKi 的基因组 RNA 和 sRNAs 的积累  79-80
    4.4.5 HSVd- KY04 和 KFKi 的结构稳定性  80-81
    4.4.6 HSVd-KY04 和 KFKi 的高通量测序  81-82
    4.4.7 HSVd-sRNAs (21~24 nt) 的分析  82-83
    4.4.8 HSVd-sRNA 的大小分布  83-84
    4.4.9 HSVd-sRNA 的 5~’末端碱基分析  84-85
    4.4.10 HSVd-sRNA 在基因组上的不均衡分布  85-89
  4.5 讨论  89-91
    4.5.1 HSVd 在啤酒花上的进化  89
    4.5.2 HSVd-KFKi 与 HSVd-KY04 的致病性变化  89-91
全文结论  91-93
参考文献  93-105
致谢  105-106
作者简历  106

啤酒花矮化类病毒寄主适应性和致病性研究

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