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解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表达系统的构建

作　者: 赵鹤云
导　师: 闫云君
学　校: 华中科技大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 解脂耶氏酵母脂肪酶蛋白质表达系统基因筛选蔗糖水解酶基因荧光蛋白蛋白定位酪氨酸酶
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

解脂耶氏酵母是一种非常规酵母,被认为是GRAS (generally regarded as safe),其自身能利用众多廉价底物而分泌多种具有工业应用价值的代谢物,故从二十世纪六十年代后期就开始广泛应用于多种不同的工业领域。其蛋白表达系统具有以下优势：外源基因易于整合到酵母基因组、外源蛋白表达量高、所表达的蛋白质能进行翻译后加工、重组菌可进行高密度发酵,以及所表达蛋白质的低糖基化等。该酵母在分类学和分子生物学上的独特性质及其表达系统的优势使其成为最具研究价值和应用潜力的酵母之一,但其基础性研究的欠缺和现有蛋白表达系统的不完善性阻碍了其进一步应用。解脂耶氏酵母脂肪酶家族的特异性是它的众多独特性质之一,针对该家族的系统性研究为阐明其独特的分类学地位奠定基础。此外,对现有解脂耶氏酵母表达系统的改进能使其更广泛的应用于工业化生产。本实验室从中国科学院微生物研究所马延和研究员处获赠一株解脂耶氏酵母菌株CGMCC 2.1405,从其中克隆得到其脂肪酶Lip1, Lip3, Lip4及Lip5的cDNA序列,将它们进行表达后分别开展了酶学性质研究,并证实Lipl和Lip3为酯酶而非脂肪酶,修正了人们对该脂肪酶家族成员的认识。为寻找该酵母脂肪酶新基因,本文利用生物信息学分析了解脂耶氏酵母基因组中可能的脂肪酶基因,利用大肠杆菌表达系统构建小型基因库,最终采用功能筛选获得一个脂肪酶新基因(lip9),进行表达后对其酶学性质进行了研究。同时成功建立了基因克隆新方法。本文构建了解脂耶氏酵母蛋白质定位载体用于研究其脂肪酶的定位,研究发现,除Lip8为细胞壁结合脂肪酶外(Lip2之前已证实为胞外酶),其它均定位于胞内行使某种功能。本论文还构建了能利用蔗糖和酪氨酸酶作为筛选标记,且能直接应用于野生型解脂耶氏酵母株的两种新型蛋白表达系统,结果证实两种质粒稳定性好,且能用于高等真核生物蛋白质的表达。此外,上述两种表达系统为消除环境污染、扩展解脂耶氏酵母在工业上的应用范围奠定了技术基础。本论文的主要工作及创新点如下：(1)利用反转录PCR克隆了脂肪酶Lipl, Lip3, Lip4, Lip5的cDNA序列,将其在毕赤酵母中成功进行了活性表达,经Ni-NTA层析柱纯化后得到单一蛋白并研究了它们的酶学性质,首次从功能上证实Lip4, Lip5为脂肪酶,Lip1, Lip3为羧酸酯酶。(2)根据已经测得的解脂耶氏酵母基因组序列,利用生物信息学的方法,预测并扩增到18个可能的脂肪酶基因序列,用SignalP3.0对其基因结构进行分析后,在大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中进行诱导表达,利用对硝基苯酚棕榈酸酯筛选得到一脂肪酶新基因,为更深入验证其脂肪酶功能并研究其酶学性质,将其克隆入毕赤酵母中表达,经过Ni-NTA柱纯化后研究表明,其偏好水解长链酯,具有水解橄榄油的活性,进一步证实其有脂肪酶活性,将其定名为Lip9。同时建立了基因克隆的新方法。(3)扩增得到酿酒酵母蔗糖基因suc2做为营养缺陷型筛选标记,构建得到解脂耶氏酵母新的胞内和胞外表达载体pINA1297-a-TS和pINA1297-TS,通过比较证实了同源启动子pTEF更适合于工业应用。同时利用该表达系统将人源基因rho进行了成功表达。(4)在构建的新表达载体pINA1297-a-TS的基础上,利用增强型荧光蛋白EGFP构建解脂耶氏酵母蛋白质定位载体,首次对解脂耶氏酵母脂肪酶成员进行定位研究。研究表明,除Lip8外其余均定位于细胞中,Lip8结合于细胞壁上,经缓冲液洗10次后荧光湮灭,证实Lip8是非共价结合于细胞壁。(5)本文首次将编码酪氨酸酶的基因mel应用于酵母表达系统构建。经组装PCR自主合成基因mel后,再利用重叠PCR将其置于启动子pTEF和信号肽XPR2pre的下游,终止区LIP2t的上游,构建得到利用黑色素效应进行筛选的新型解脂耶氏酵母胞内及胞外表达载体pINA1297-a-MS和pINA1297-MS,两者能稳定存在于重组酵母菌基因组中,证实该表达系统构建成功。

解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表达系统的构建

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