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两种转基因水稻的定性定量检测

作　者: 钱冲
导　师: 王惠
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 转基因水稻标准质粒定性PCR 定量PCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

根据转基因水稻T1c-195’旁侧序列信息,获得其5’端的特异性结构,通过对这段序列中转基因元件的筛查并设计定性PCR引物Tlc-19f/r,建立了抗虫水稻Tic-19品系特异性常规定性PCR方法。又根据转基因水稻T2A-13’旁侧序列信息,获得其3’端的特异性结构,通过对这段序列中转基因元件的筛查并设计定性PCR引物T2A-1f/r,建立了抗虫水稻Tlc-19品系和T2A-1品系特异性常规定性PCR方法。通过对内标基因gos9,品系特异性检测,以及定性PCR灵敏度测试的结果可知,定性PCR检测的体系是稳定的,检测结果是可靠的。定性PCR的检测限均为0.01%。又应用重叠PCR的方法,将含有T1c-195’旁侧序列和T2A-13’旁侧序列分别与水稻内标基因gos9序列两个特异片段连接转化到pMD-20T载体中构建标准质粒,分别命名pMD-lc和pMD-2A。以标准质粒分子作为标准物质,分别建立了转基因水稻T1c-19和转基因水稻T2A-1实时荧光定量PCR方法,通过对标准曲线回归方程的分析,可知DNA含量和循环域值之间的良好线性关系表明标准质粒分子可以用于定量检测,对已知5%、0.25%和5%、0.5%的两个不同转基因含量的混合样品进行定量检测,检测结果的准确性偏离率(bias),精确性标准差(SD),相对标准差(RSD)均在25%之内也说明定量检测的可靠性。因此可知本试验建立的定性及定量检测方法用于转基因水稻Tlc-19和转基因水稻T2A-1的检测是可靠的,准确的。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-10
第一章绪论  10-27
  1.1 转基因作物及其种植情况  10-13
    1.1.1 转基因作物  10
    1.1.2 全球转基因作物的种植情况  10-12
    1.1.3 我国转基因水稻的研发情况  12-13
  1.2 转基因作物的安全性及管理制度  13-15
    1.2.1 转基因作物的安全性  13
    1.2.2 转基因作物安全评价遵循的原则  13-14
    1.2.3 转基因作物的标识管理制度  14-15
  1.3 转基因作物的检测方法  15-24
    1.3.1 以核酸为靶标的检测方法  15-22
    1.3.2 以蛋白为靶标的检测方法  22-23
    1.3.3 其他检测技术  23-24
  1.4 本文的研究背景及主要内容  24-27
    1.4.1 研究背景  24-26
    1.4.2 研究内容  26-27
第二章转基因水稻Tlc-19和T2A-1定性PCR检测方法的建立  27-43
  2.1 材料仪器与方法  28-36
    2.1.1 材料、仪器  28
    2.1.2 两种转基因水稻基因组DNA提取  28-29
    2.1.3 转基因元件筛查  29-32
    2.1.4 定性PCR检测方法的建立  32-36
  2.2 试验结果  36-43
    2.2.1 转基因水稻基因组DNA提取和内标准基因的验证结果  36-37
    2.2.2 转基因元件筛查结果  37-39
    2.2.3 定性PCR检测结果  39-43
第三章转基因水稻Tlc-19和T2A-1标准质粒构建及定量检测方法的建立  43-56
  3.1 材料和仪器  43
  3.2 标准质粒的构建  43-48
    3.2.1 重叠PCR  44
    3.2.2 连接、转化  44-45
    3.2.3 菌落PCR验证  45-46
    3.2.4 标准质粒的构建结果  46-48
  3.3 定量PCR方法的建立  48-54
    3.3.1 引物和探针设计  48-49
    3.3.2 反应体系和反应条件  49
    3.3.3 定量结果分析与验证  49-54
  3.4 讨论  54-56
第四章全文总结及标准质粒的应用前景  56-58
参考文献  58-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表的文章  66

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