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广西眼镜蛇毒中NGF和Natrin的分子生物学及性质研究

作　者: 宋慧
导　师: 舒雨雁
学　校: 广西医科大学
专　业: 药理学
关键词: 广西眼镜蛇毒 神经生长因子 纯化 克隆 表达 NACC细胞凋亡 Natrin 富含半胱氨酸分泌蛋白(CRISPs) 肝脏脂质过氧化作用(LPO) 凋亡 胃癌MGC-803细胞
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的:对来源于广西眼镜蛇毒的神经生长因子(NGF)蛋白的基因进行体外扩增、克隆及序列分析,并表达。研究广西眼镜蛇毒神经生长因子诱导人类小涎腺腺样囊性癌细胞(NACC)凋亡的影响。方法:采用Trizol法从广西眼镜蛇毒腺中提取总RNA,经RT-PCR扩增出广西眼镜蛇毒中的NGF的cDNA,测序后与其它来源的NGF比较同源性;将来源于广西眼镜蛇毒的NGF蛋白的基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出NGF。利用蛋白印迹分析其是否有NGF抗原活性及用PC12细胞进行生物活力测定并通过细胞计数法与天然蛇毒NGF的活性比较。应用HE染色观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果:广西眼镜蛇毒中的NGF可在大肠杆菌中克隆和表达。DNA软件分析其有110 Amino Acids,Molecular Weight为12346.93 Daltons,等电点为7.643。经蛋白印迹分析可知其具有NGF抗原活性,PC12细胞生物活力测定结果显示经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,为进一步研究NGF的结构和功能关系提供更多的信息。形态学观察到用药后的NACC细胞质空泡、核固缩、核染色质聚集等形态学变化现象。流式细胞仪检测到试验组细胞凋亡率高于对照组,说明广西眼镜蛇毒神经生长因子能诱导NACC细朐凋亡。目的:从广西眼镜蛇毒中分离纯化出Natrin,测定其生物化学性质;对来源于广西眼镜蛇毒中的Natrin蛋白基因进行体外扩增、克隆及序列分析,并表达;探讨蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用(LPO)的影响,广西眼镜蛇毒Natrin是否对胃癌MGC-803细胞有诱导凋亡的作用。方法:广西眼镜蛇毒经过CM-SepharoseCL-6B柱、Sephadex G-50柱及FPLCmono S柱层析,分离纯化出Natrin;从广西眼镜蛇毒腺中抽提总RNA,经过RT-PCR得到cDNA作模板,根据广西眼镜蛇毒液中分离纯化的Natrin的N-端及C-端部分氨基酸序列的测定结果设计了兼并引物,利用PCR的方法扩增和克隆了Natrin。将来源于广西眼镜蛇毒Natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体PMAL-c2x中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.3mMIPTG诱导表达4小时。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,经蛋白印迹分析其是否有Natrin抗原活性。采用肝细胞匀浆硫代巴比妥酸比色法(体外法),加入一系列浓度样品,然后测定大鼠肝脏线粒体脂质过氧化作用产物丙二醛(MDA)含量。采用MTT法测定眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞生长活力的影响;用AO/EB双染色法、双免疫荧光染色(Annexin V/PI)和流式细胞仪技术检测广西眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞的凋亡作用。结果:成功地从广西眼镜蛇毒中分离纯化出Natrin,经SDS-PAGE测定分子量为25KD,质谱测定分子量为24937Da,等电聚焦电泳pI约为8.3,测得N端的序列为NVDFNSESTRRKKKQKEIVD;广西眼镜蛇毒的Natrin可在大肠杆菌中克隆和表达。经蛋白印迹分析可知其具有Natrin抗原活性,说明Natrin在大肠杆菌中成功地表达了,为进一步研究Natrin的结构和功能关系提供更多的信息。在探讨蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用(LPO)的影响中随着Natrin的浓度增高,其对大鼠肝脏具有一定的抑制作用。广西眼镜蛇毒Natrin对胃癌MGC-803细胞有诱导凋亡作用。

全文目录


主要中英文缩写  5-6
第一部分 广西眼镜蛇毒中神经生长因子的分子生物学研究  6-57
  第一部分中文摘要  6-7
  第一部分英文摘要  7-10
  第一篇 广西眼镜蛇毒中NGF的克隆及序列分析  10-21
    1. 材料与仪器  10
    2. 实验步骤与方法  10-16
    3. 结果与讨论  16-21
  第二篇 广西眼镜蛇毒中NGF在E.coli中的的表达  21-32
    1. 材料与仪器  21-22
    2. 实验步骤与方法  22-26
    3. 结果与讨论  26-32
  第三篇 广西眼镜蛇毒中NGF诱导人类小涎腺腺样囊性癌细胞株凋亡的作用  32-37
    1 材料与仪器  32-33
    2 实验步骤和方法  33-34
    3 结果和讨论  34-37
  第一部分小结  37-38
  第一部分实验参考文献  38-40
  第一部分综述  40-57
    第一部分综述参考文献  53-57
第二部分 广西眼镜蛇毒中Natrin的分子生物学及性质研究  57-107
  第二部分中文摘要  57-58
  第二部分英文摘要  58-60
  第一篇 广西眼镜蛇毒中Natrin的分离和纯化  60-70
    1 材料与方法  60
    2 方法  60-63
    3 结果与讨论  63-70
  第二篇 广西眼镜蛇毒中Natrin的克隆及在E.coli中的表达  70-87
    1. 材料和方法  70-81
    2 结果  81-85
    3 讨论  85-87
  第三篇 广西眼镜蛇毒蛋白Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用的影响研究  87-91
    1 材料与方法  88-89
    2 结果  89-90
    3 讨论  90-91
  第四篇 广西眼镜蛇毒蛋白Natrin对胃癌MGC-803细胞的凋亡作用  91-97
    1 材料与方法  91-93
    2 结果  93-95
    3. 讨论  95-97
  第二部分小结  97-98
  第二部分实验参考文献  98-100
  第二部分综述  100-107
    第二部分综述参考文献  104-107
攻读博士期间已发表的文章  107-108
致谢  108

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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