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新生血管与斑块稳定性的关系及VEGF基因干预的研究

作　者: 丁士芳
导　师: 张运
学　校: 山东大学
专　业: 内科学
关键词: 血管内皮生长因子 腺病毒载体 RNA干扰 短发夹RNA 慢病毒载体 动脉粥样硬化 易损斑块 新生血管 血流动力学 剪切力 通透性 斑块
分类号: R543
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的:构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ分别对质粒PDC-VEGF和PDC315进行酶切,凝胶电泳鉴定、回收纯化目的DNA片段,连接目的片段并转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ酶切和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12天出现病毒空斑效应。提取重组腺病毒DNA,通过PCR扩增法鉴定构建的腺病毒。大量扩增、氯化铯梯度离心纯化、浓缩重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应将3973bp VEGF165片段正确插入538bp PDC315载体,酶切电泳分析和测序证明正确构建重组质粒PDC315-VEGF。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,扩增出421bp VEGF165基因片段,证实携带人VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/ml。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒ad.VEGF,为动物试验奠定基础。目的:利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,以小鼠VEGFa基因（NM001025257）靶基因,构建携带短发夹状干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体。方法:1.根据小鼠VEGFa mRNA序列（NM001025257）,选择针对VEGF cds区3个19nts靶序列,设计并合成三对包含正反义靶序列的互补DNA链（siRNA1、siRNA2、siRNA3）,同时设计并合成一对针对无关序列的互补DNA链为阴性对照（Negative）。退火与线性化pRNAT-U6.2/Lenti质粒连接、转化感受态细胞DH5α,扩增、纯化质粒,通过PCR扩增以及基因测序鉴定片段大小及插入片段序列。2.钓取小鼠NIH/3T3细胞总RNA,利用RT-PCR方法大量扩增、纯化小鼠NIH/3T3细胞VEGFa cDNA,将BamHⅠ和EcoRⅠ酶切VEGFa基因片段与线性化处理pCDH1质粒进行连接、转化感受态细胞DH5α,构建携带小鼠VEGFa基因表达质粒pCDNA-VEGF。扩增、纯化质粒,通过PCR扩增后进行琼脂糖电泳以及基因测序鉴定片段大小及插入片段序列。3.实验分6组,用脂质体将pCDNA-VEGF质粒或/和siRNA慢病毒质粒共转染NIH/3T3细胞,通过荧光Real time PCR和Western blot检测NIH/3T3细胞VEGF基因表达水平,筛选最有效抑制VEGF基因表达siRNA慢病毒表达质粒。4.通过脂质体分别将最有效抑制小鼠VEGFa基因表达的siRNA慢病毒表达质粒和pRNAT-Negative慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒混合物混合,共转染293T细胞,24h后观察绿色荧光表达情况,转染48h后收集慢病毒上清。用慢病毒液转染96孔板培养的293T细胞,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定慢病毒滴度。结果:1.特异性合成DNA链退火后定向克隆到线性化pRNAT-U6.2/Lenti质粒,PCR扩增出316bp或317bp目的基因片断,重组质粒测序结果与设计siRNA序列完全一致,成功构建针对小鼠VEGFa基因的特异性siRNA慢病毒表达质粒。2.自NIH/3T3细胞获取高质量总RNA,通过RT-PCR扩增VEGFa cDNA,克隆VEGFa cDNA长885bp。构建pCDNA-VEGF质粒为1077bp（含有864bpVEGFa基因片断和213bp pCDNA载体片断）,插入小鼠VEGFa寡核苷酸序列与设计序列完全相符。3.pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa mRNA和蛋白表达水平,siRNA1、siRNA2、siRNA3慢病毒表达质粒抑制pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa mRNA和蛋白的表达水平,特别是pRNAT-siRNA3抑制作用最明显,VEGFa mRNA和蛋白表达均下降70%以上,pRNAT-negative慢病毒表达质粒对pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa mRNA和蛋白表达水平无抑制作用。因此,pRNAT-siRNA3慢病毒表达质粒基因沉默效果最好。4.通过脂质体分别将pRNAT-siRNA3质粒和pRNAT-negative质粒与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,24h后观察293T细胞有绿色荧光表达,成功建立慢病毒载体的包装细胞。转染48h收集慢病毒上清,浓缩、纯化后的慢病毒滴度均为l×108 ifu/ml。结论:通过RNA干扰技术,成功设计、筛选、生产针对小鼠VEGFa基因沉默的特异性siRNA慢病毒,为动物试验奠定基础。背景动脉粥样斑块内新生血管内皮细胞连接不紧密、内皮下缺乏基底膜、管壁无平滑肌细胞,具有通透性高和脆性大的特点,易于破裂出血。VEGF是高度特异性血管内皮细胞有丝分裂素,在血管新生发挥重要作用,是促进或抑制新生血管形成的靶点。目前,动脉粥样斑块破裂与粥样斑块内新生血管之间的关系有争议。因此,建立apoE-/-。小鼠颈动脉粥样斑块模型,干预粥样斑块内新生血管形成,有助于阐明粥样斑块内血管新生、斑块内出血、粥样斑块破裂的相互关系。目的建立apoE-/-小鼠颈动脉粥样斑块模型,将携带目的基因病毒经动脉外膜转染动脉粥样斑块,通过促进或抑制粥样斑块内新生血管形成,明确粥样斑块内新生血管形成、斑块内出血、粥样斑块破裂的相互关系及其机制。方法1.动物模型:164只8w雄性apoE-/-小鼠,均给予高脂高胆固醇喂养。通过缩窄性颈动脉套管建立apoE-/-小鼠左颈总动脉粥样斑块模型。按20%浓度（V/V）将pluronic-127 gel加入Ad.VEGF（5×109pfu/ml）、Ad.lacZ（5×109pfu/ml）、siRNA.VEGF（1×1O8ifu/ml）、siRNA.Negative（1×108ifu/ml）,制成转染用腺病毒或慢病毒溶液。缩窄性颈动脉套管4w后,去除缩窄性硅胶套管。将100ul病毒液均匀涂抹左颈总动脉外膜,室温孵育20min。术毕,继续高脂饲养4w。局部基因转染2w时,自Ad.lacZ组、siRNA.Negative组分别随机处死2只apoE-/-小鼠,观察粥样斑块内β-半乳糖苷酶和GFP表达,判断局部基因转染的可行性和有效性。2.血脂水平测定:检测各组apoE-/-小鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量。3.病理学检测:每组20只apoE-/-小鼠,对左颈总动脉粥样斑块分别进行HE染色、油红O染色、Masson染色、天狼猩红染色、Perl’s染色（含铁血黄素染色）,通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞（MOMA-2）、平滑肌肌动蛋白（α-actin）、血管内皮生长因子（VEGF）、vWF、纤维蛋白原、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）的蛋白表达。统计粥样斑块破裂（斑块内出血和血栓形成）发生率,计算易损指数=（巨噬细胞+脂质）阳性面积百分比/（平滑肌细胞+胶原）阳性面积百分比。4.实时荧光定量RT-PCR检测基因表达:每组12只apoE-/-小鼠左颈总动脉,每3只混合提取新鲜粥样斑块组织RNA,实时荧光定量PCR检测VEGF、MMP2、MMP9 mRNA表达水平。5.免疫印迹技术（Western blot）检测蛋白表达:每组8只左颈总动脉,混合后提取粥样斑块组织蛋白,Western blot检测VEGF、MMP9的蛋白表达水平。结果1.ApoE-/-小鼠基本特征:缩窄性颈动脉套管、去除套管以及颈动脉外膜局部转染病毒的手术顺利,实验期间无apoE-/-小鼠意外死亡。各组apoE-/-小鼠血脂含量及体重比较差异无统计学意义（p＞0.05）。2.颈动脉外膜局部有效转染腺病毒或慢病毒液:颈动脉局部转染ad.LacZ腺病毒2w,颈动脉外膜、中膜、新生内膜均分布β-半乳糖苷酶蓝色颗粒;携带GFP基因的慢病毒转染2w,颈总动脉粥样斑块有强GFP表达,极少分布于其他脏器。腺病毒和慢病毒可将携带目的基因,通过血管外膜成功转染粥样斑块。局部转染基因影响粥样斑块内VEGF合成,免疫组化示Ad.VEGF组粥样斑块内VEGF呈弥漫性强阳性表达（69.97±2.74%）,荧光实时定量RT-PCR和Western blot示粥样斑块VEGF mRNA和VEGF蛋白（1.76±0.32）表达最高;siRNA.VEGF组粥样斑块内VEGF表达最弱（14.33±1.37%）,荧光实时定量PCR和Western blot均显示siRNA.VEGF组粥样斑块VEGF mMRNA和VEGF蛋白（0.22±0.02）表达最弱。3.局部基因转染对粥样斑块大小及斑块成分的影响:颈动脉局部转染Ad.VEGF组粥样斑块面积最大,siRNA.VEGF组粥样斑块面积最小,Ad.LacZ组和siRNA.Negative组粥样斑块面积差异无统计学意义。各组均形成以脂质沉积为主粥样斑块,脂质含量差异有统计学意义。Ad.VEGF组斑块α-SM actin含量最少（8.35±0.3%）,siRNA.VEGF组粥样斑块内α-SM actin含量最多（19.01±1.17%）。Ad.VEGF组粥样斑块纤维帽最薄（6.07±0.25um）,siRNA.VEGF组粥样斑块纤维帽最厚（15.40±1.46um）。粥样斑块内胶原分布呈类似表现,Ad.VEGF组粥样斑块胶原含量最少（10.11±1.05%）,siRNA.VEGF组粥样斑块胶原含量最多（25.61±1.69%）。Ad.VEGF组粥样斑块内巨噬细胞含量最多（22.18±1.87%）,siRNA.VEGF组粥样斑块巨噬细胞含量最少（8.25±0.86%）。Ad.VEGF组粥样斑块内MMP2、MMP9呈弥漫性强阳性分布,荧光实时定量RT-PCR显示Ad.VEGF组粥样斑块内MMP2 mRNA、MMP9 mRNA表达含量最高,Western blot显示Ad.VEGF组粥样斑块内MMP9以具有酶活性蛋白表达为主:siRNA.VEGF组粥样斑块内MMP9呈局限性弱阳性分布,粥样斑块内MMP2 mRNA、MMP9 mRNA表达含量最弱,斑块内以不具有酶活性的MMP9蛋白前体为主。Ad.VEGF组粥样斑块易损指数显著升高（3.59±0.42）,高于Ad.LacZ组（2.08±0.17）、siNRA.Negative组（2.03±0.18）、siRNA.VEGF组（1.12±0.08）（P均＜0.001）。siNRA.Negative组和siRNA.VEGF组粥样斑块易损指数差异无统计学意义（p＞0.05）。4.基因转染对斑块内新生血管形成及斑块稳定性的影响:根据vWF染色结果,粥样斑块内新生血管形成,新生血管管壁薄,多由单个或数个内皮细胞构成,无SMC组成。Ad.VEGF组斑块内新生血管密度最高（24.0±1.9）,siRNA.VEGF组斑块内新生血管密度最低（6.6±1.2）。Ad.VEGF组粥样斑块破裂发生率最高,分别有8例（40%）发生斑块内出血和6例（30%）血栓形成,其中3例直视下可见粥样斑块近心端附壁血栓形成。Ad.LacZ组分别有2例（10%）斑块内出血和1例（5%）血栓形成,siRNA.VEGF组和siRNA.Negative组分别有2例（10%）斑块内出血,Pearson Chi-Square检验差异有统计学意义。结论（1）通过颈动脉外膜局部转染方式,可将目的基因高效转染粥样斑块。（2）粥样斑块局部转染Ad.VEGF165,促进斑块内新生血管形成,增加粥样斑块破裂发生率。（3）VEGFa基因沉默显著抑制粥样斑块进展,降低粥样斑块易损指数,增加粥样斑块稳定性。目的人类动脉粥样硬化病变主要发生在大、中动脉弯曲、分又及狭窄部位,如主动脉弓、颈动脉分支、冠状动脉、腹主动脉分支和股动脉分支等血流缓慢或涡流部位,即低管壁剪切力区。ApoE-/-小鼠是研究动脉粥样硬化较理想动物模型,但小鼠主动脉管壁剪切力约为人主动脉管壁剪切力的20倍。利用Visualsonics Vevo770显微超声仪实时无创性观察小鼠血流动力学变化,研究管壁剪切力在apoE-/-小鼠动脉粥样斑块形成过程中的作用。方法高脂高胆固醇饲料饲养apoE-/-小鼠,将内径0.3mm缩窄性或内径0.6mm非缩窄性硅胶管套扎apoE-/-小鼠左颈总动脉。静脉注射HRP（50mg/kg体重）观察缩窄性套管和非缩窄性套管对apoE-/-小鼠动脉管壁通透性的影响。应用显微超声仪于相应观察时间点进行颈动脉超声检查,根据τ（dyne/cm2）=4·V·η/ID公式计算动脉管壁剪切力。将颈动脉标本进行拍照和免疫组织化学分析。结果apoE-/-小鼠颈总动脉内经0.51±0.02mm,管壁剪切力33.4±2.5dynes/cm2,内经0.3mm缩窄性套管导致颈总动脉狭窄≈64%,缩窄性套管近端颈总动脉管壁剪切力降至12.2±0.8dynes/cm2,而缩窄性套管段颈总动脉管壁剪切力显著升高至98.5±7.7dynes/cm2。静脉注射HRP显示缩窄性套管段和缩窄性套管近端颈总动脉管壁通透性均增加。缩窄性套管近端颈总动脉形成以脂质沉积和单核/巨噬细胞黏附浸润为主粥样斑块,缩窄性套管段颈总动脉形成以收缩型平滑肌细胞为主的中膜增生,但无脂质沉积和单核/巨噬细胞黏附浸润。结论①在高脂喂养基础上,通过缩窄性套管加速apoE-/-小鼠颈总动脉粥样斑块形成;②apoE-/-小鼠颈总动脉管壁剪切力较人类高;③低管壁剪切力有促动脉粥样斑块形成作用;④高管壁剪切力抑制动脉粥样斑块形成;⑤显微超声仪可以实时无创性检测apoE-/-小鼠血流动力学在动脉粥样斑块形成中的作用。

全文目录


论文Ⅰ 携带人VEGF_(165)基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定  10-36
  中文摘要  10-11
  英文摘要  11-13
  前言  13-14
  材料  14-16
  方法  16-22
  结果  22-23
  讨论  23-25
  结论  25-26
  附图  26-34
  参考文献  34-36
论文Ⅱ 特异性针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒载体的构建  36-86
  中文摘要  36-38
  英文摘要  38-41
  前言  41-42
  材料  42-45
  方法  45-63
  结果  63-65
  讨论  65-69
  结论  69-70
  附表  70-72
  附图  72-84
  参考文献  84-86
论文Ⅲ 新生血管与斑块稳定性的关系及VEGF基因干预的研究  86-150
  中文摘要  86-90
  英文摘要  90-94
  前言  94-95
  材料与方法  95-108
  结果  108-110
  讨论  110-120
  结论  120-121
  附表  121-122
  附图  122-140
  参考文献  140-150
论文Ⅳ 管剪切力在apoE~(-/-)小鼠总动脉粥样硬化斑块形成中的作用  150-185
  中文摘要  150-152
  英文摘要  152-154
  前言  154-155
  材料与方法  155-159
  结果  159-161
  讨论  161-165
  结论  165-166
  附表  166-167
  附图  167-179
  参考文献  179-185
致谢  185-186
攻读博士学位期间的学术成果  186-187
SCI论文Ⅰ  187-200
SCI论文Ⅱ  200-220

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