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大豆疫霉侵染早期机制的分子解析

作　者: 陈孝仁
导　师: 郑小波
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉 致病性 抑制性差减杂交 绿色荧光蛋白 早期侵染 转录基因沉默
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


大豆疫霉Phytophthora sojae是农业生产上极为重要的植物病原菌之一，由其引起的大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。由于疫霉菌与真菌亲缘关系较远，普通杀菌剂对疫霉菌无效。了解大豆疫霉菌生长发育与致病过程的分子遗传学基础，可以为寻找新的杀菌剂作用靶标，设计新的疫病控制策略提供理论指导。大豆疫霉原生质体制备及再生菌株生物学性状研究。尝试建立大豆疫霉遗传转化体系，首先对大豆疫霉菌株原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究。结果表明：Driselase以及Driselase-Lysing enzyme的混合酶液均能有效地裂解菌株PS2的细胞壁并获得原生质体；其中混合酶液的裂解效果优于Driselase单一酶液，当混合酶液中两个酶的浓度均为15mg·mL-1时，在30℃条件下消化3h后可以产生浓度达4×106 mL-1的原生质体。所制备的原生质体经细胞核染料4,6-diamidino-2-phenyl-indole（DAPI）染色后发现，大型均一的原生质体内含有细胞核；原生质体在再生培养基上再生率达1.0％，再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状，其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致。利用GFP研究大豆疫霉与大豆的互作。利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导转化原生质体方案，将报告基因绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，gfp）转入大豆疫霉，gtp能够在大豆疫霉各生活阶段稳定表达。而且，利用该报告基因系统研究了大豆疫霉在寄主叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析寄主抗性在根部的差异。结果是，gfp基因能够在大豆疫霉菌中稳定表达，菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子都观察到荧光；利用GFP可以清楚地观察到大豆疫霉在寄主大豆体内的侵染情况；而且，利用GFP标记，在抗性大豆品种南农8848、威廉姆斯82和感病品种合丰35、威廉姆斯的根部能够观察到大豆疫霉休止孢萌发的芽管长度明显不等长，抗性品种上萌发形成的芽管长于感病品种上形成的芽管。大豆疫霉早期互作表型研究。为发展控制大豆疫霉根腐病的更好方法，理解大豆疫霉如何逃避或抵抗大豆防卫机制非常重要。大豆疫霉与大豆互作早期，包括前期侵染（pre-infection）阶段，发生许多重要的互作事件。侵入前，大豆疫霉识别寄主信号，形成侵染相关结构，同时也必须对抗寄主先天抗性和入侵引起的诱导抗性。而且，病原物也必须面对侵染早期营养缺乏的情况。大豆疫霉因而须调节自身基因的表达，来应对寄主和环境压力，并且避免被寄主识别。因此，本研究首先分析了大豆疫霉与寄主大豆、非寄主番茄和中国不结球小青菜互作早期双方的表型。结果揭示大豆疫霉在与植物互作早期菌丝尖端均发生变细变长，寄主和非寄主则发生活性氧的迸发。模拟自然条件下大豆疫霉应答氧化压力，结果发现在1mM的过氧化氢终浓度下，游动孢子迅速休止，并且在观察的10h内没有萌发；而在0.3mM的过氧化氢终浓度下，游动孢子的萌发率高于对照，并且芽管的长度长于对照。提示过氧化氢在游动孢子识别寄主、萌发和侵入中可能起着重要作用。游动孢子在大豆叶片、下胚轴和根部均产生明显的附着胞或类似附着胞结构。大豆与大豆疫霉互作相关的氧化压力反应。重点研究了大豆与大豆疫霉互作早期大豆体内活性氧的代谢活动。利用分光光度法分析了两种不同抗性水平的大豆在与大豆疫霉互作中活性氧的迸发、寄主细胞死亡、脂质过氧化程度、抗氧化酶（过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶）和非酶促抗氧化剂（抗坏血酸和谷胱甘肽）的含量变化。而且，利用染色法对寄主活性氧迸发和细胞死亡进行了研究；分析了互作中大豆叶片致病防卫相关基因的表达变化及外源施用还原剂对互作的影响。结果表明，在接种后，抗病品种（南农493-1）和感病品种（合丰35）均发生了活性氧迸发。受大豆疫霉菌侵染后，大豆各品种都产生了细胞的死亡；丙二醛含量变化趋势与品种抗性呈负相关；在接种后3h内，不同抗性品种体内过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶比活性均上升。大豆疫霉侵染大豆诱导大豆PRS（pathogenesis-related protein genes，PRs）基因的上调表达，在南农493-1中上调表达时间早于合丰35，持续时间也长于后者；外源施用三种还原剂DTT、glutathione、ascorbate均有助于大豆疫霉菌的侵染。结果表明，活性氧代谢可能在大豆与大豆疫霉菌互作中起着重要作用。大豆疫霉侵染早期诱导表达基因的筛选。为探究大豆疫霉致病性的分子机制，利用抑制性差减杂交方法筛选大豆疫霉侵染大豆早期诱导表达基因，建立了一个大豆疫霉侵染早期诱导表达cDNA文库。该文库包含73个单基因，其中66个在大豆疫霉基因组数据库具有同源序列，7个没有同源序列。这些基因涉及蛋白合成、能量代谢、细胞信号转导、细胞壁建成和转录调节等途径。这些结果为了解大豆疫霉早期侵染大豆过程中差异表达的基因以及卵菌的致病机理提供了依据。大豆疫霉C2H2型锌指蛋白基因的克隆、表达分析及功能验证。从大豆疫霉侵染早期诱导表达文库中克隆出两个基因Pszfl和Psbadhl的全长，并进行了拷贝数分析、聚类分析、转录水平分析，利用转录基因沉默技术研究了这两个基因在大豆疫霉中的功能。分析的结果对于理解大豆疫霉早期侵染机制提供了重要的数据。Pszfl编码一个C2H2型锌指蛋白，在大豆疫霉中为单拷贝。在1mM H2O2压力下、试验观察的2h内，该基因的表达水平一直升高；在与寄主互作的24h内，转录水平也一直增高。沉默突变体表现出对过氧化氢敏感。结果表明，Pszfl基因可能参与了大豆疫霉早期侵染过程中氧化压力调节。大豆疫霉等渗调节基因Psbadhl的克隆与功能分析。Psbadhl可能编码一个甜菜碱醛脱氢酶，其氨基酸序列与拟南芥Arabidopsis thialiana的一个甜菜碱醛脱氢酶的序列有55％的同源性，具有甜菜碱醛脱氢酶的保守结构域“xxLELGGKSP”。酶活力测定证实PsBADH1具有甜菜碱醛脱氢酶活性。系统发育分析表明，该基因在系统发育树中与高等真菌相距较远。Southern杂交结果显示，Psbadhl在大豆疫霉基因组中只有1个拷贝。对Psbadhl进行了转录基因沉默分析，结果显示，在所获得的28个转化子中，有2个转化子表现出盐敏感；RT-PCR分析表明，在这2个转化子中检测不到Psbadhl的mRNA的积累，结果揭示Psbadhl与大豆疫霉的等渗调节具有密切关系。

全文目录


中文摘要  9-12
ABSTRACT  12-16
引言  16-18
上篇 文献综述  18-63
  第一章 植物病原卵菌分子遗传学研究进展  18-42
    1 卵菌的分类地位  19
    2 卵菌病害  19-20
    3 植物病原卵菌的生活史  20-21
    4 卵菌与植物的相互作用  21-28
      4.1 孢子囊的形成到游动孢子的游动  21-22
      4.2 游动孢子寻根策略  22-24
      4.3 游动孢子休止和定殖  24-25
      4.4 休止孢萌发、附着胞或类似附着胞结构的形成  25-26
      4.5 卵菌与植物的互作  26-28
    5 生物防治  28-29
    6 卵菌的遗传操作  29-32
      6.1 卵菌转化技术和基因沉默研究  29-30
      6.2 基因沉默机制  30-31
      6.3 TILLING技术  31
      6.4 蛋白质组研究  31-32
      6.5 噬菌体展示技术  32
    参考文献  32-42
  第二章 真核病原生物的侵染策略  42-63
    1 Plasmodium falciparum侵染人体红血球  43-45
    2 Phytophthora infestans侵染植物  45-46
    3 真核病原生物的寄主定位信号  46-48
    4 真核病原生物寄主定位功能域的保守性  48-49
    5 寄主定位泌出蛋白组的比较  49-53
    6 侵染机制上其他的相似性  53-55
      6.1 入侵和穿透寄主的机制  53-54
      6.2 病原物繁殖时抑制寄主的蛋白酶  54-55
    7 真核病原生物的聚类关系  55
    8 总结  55-57
    参考文献  57-63
下篇 研究内容  63-173
  第一章 大豆疫霉原生质体制备及再生菌株生物学性状研究  64-74
    1 材料与方法  65-67
      1.1 供试菌株和大豆品种  65-66
      1.2 原生质体制备  66
      1.3 原生质体和细胞核观察  66-67
      1.4 原生质体再生率测定  67
      1.5 原生质体再生菌株的生长速率和致病性测定  67
    2 结果与分析  67-70
      2.1 原生质体制备条件的确定  67-69
      2.2 原生质体形成机制  69
      2.3 原生质体再生菌株的生物学性状  69-70
    3 讨论  70-71
    参考文献  71-74
  第二章 利用GFP研究大豆疫霉与大豆的互作  74-90
    1 材料与方法  76-79
      1.1 供试菌株和大豆品种  76-77
      1.2 大豆疫霉转化载体  77
      1.3 大豆疫霉的转化  77
      1.4 GFP转化子的筛选确认和表达观察  77-78
      1.5 生物学测定  78
      1.6 转GFP菌株侵染大豆叶片、下胚轴、幼根的观察  78-79
    2 结果与分析  79-84
      2.1 GFP转化大豆疫霉的结果  79
      2.2 GFP转化子的遗传稳定性分析  79-82
      2.3 GFP示踪大豆疫霉侵染过程  82
      2.4 亲和与非亲和互作芽管长度的比较  82-84
    3 讨论  84-86
    参考文献  86-90
  第三章 大豆疫霉早期侵染互作表型研究  90-104
    1 材料与方法  92-94
      1.1 大豆疫霉菌株  92
      1.2 供试植物  92
      1.3 与植物互作的大豆疫霉菌丝观察  92-93
      1.4 植物叶片染色  93
      1.5 大豆疫霉附着胞的形成  93
      1.6 过氧化氢对游动孢子休止、萌发的影响  93-94
    2 结果与分析  94-101
      2.1 与植物互作的大豆疫霉菌丝观察  94-95
      2.2 大豆疫霉附着胞的形成  95-96
      2.3 与大豆疫霉互作的寄主和非寄主植物反应表型  96
      2.4 过氧化氢对游动孢子行为的影响  96-101
    3 讨论  101
    参考文献  101-104
  第四章 大豆与大豆疫霉互作相关的氧化压力反应  104-126
    1 材料与方法  106-109
      1.1 供试菌株和大豆品种  106
      1.2 H_2O_2的原位检测及其动态变化  106-107
      1.3 过敏反应细胞死亡检测  107
      1.4 互作中大豆PRs基因的转录水平变化  107-108
      1.5 丙二醛含量动态变化  108
      1.6 抗坏血酸和谷胱甘肽含量的变化  108-109
      1.7 抗氧化系统酶活力测定  109
      1.8 外源施用还原剂对互作的影响  109
    2 结果与分析  109-120
      2.1 大豆叶片中H_2O_2进发的组织定位和动态变化  109-111
      2.2 病原菌诱导植物细胞死亡检测  111-113
      2.3 大豆疫霉菌诱导大豆叶片防卫基因表达  113-114
      2.4 抗氧化系统在互作中的作用  114-118
      2.5 外源施用还原剂对互作的影响  118-120
    3 讨论  120-122
    参考文献  122-126
  第五章 大豆疫霉侵染早期诱导表达基因的筛选  126-146
    1 材料与方法  128-132
      1.1 供试菌株和大豆材料  128-129
      1.2 供试药剂和培养基  129
      1.3 大豆接种  129-130
      1.4 SSH差异筛选  130
      1.5 dot-blot assay  130
      1.6 DNA序列分析  130-131
      1.7 virtual Northerns  131
      1.8 反转录PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)  131-132
    2.结果与分析  132-139
      2.1 正向差减cDNA文库的建立  132-133
      2.2 dot blots分析  133-135
      2.3 DNA序列分析  135-139
      2.4 Virtual Northern分析  139
      2.5 RT-PCR分析  139
    3 讨论  139-142
    参考文献  142-146
  第六章 大豆疫霉C_2H_2型锌指蛋白基因的克隆、表达分析及功能验证  146-160
    1 材料与方法  147-151
      1.1 供试菌株和大豆品种  147-148
      1.2 供试药剂和培养基  148
      1.3 大豆疫霉的接种及菌丝基因组DNA、RNA的提取和CDNA合成  148-149
      1.4 Pszfl基因克隆、载体构建及序列分析  149
      1.5 大豆疫霉的转化  149-150
      1.6 致病性测定  150
      1.7 对H_2O_2的耐受性  150
      1.8 Southern杂交  150
      1.9 Pszfl的转录水平分析  150-151
    2 结果与分析  151-155
      2.1 Pszfl基因克隆与序列分析  151-152
      2.2 Pszfl的转录水平分析  152
      2.3 Pszfl参与大豆疫霉的侵染和活性氧代谢  152-155
    3 讨论  155-157
    参考文献  157-160
  第七章 大豆疫霉等渗调节基因Psbadhl的克隆与功能分析  160-173
    1 材料与方法  161-164
      1.1 供试菌株和大豆品种  161
      1.2 供试药剂和培养基  161-162
      1.3 大豆疫霉的接种及菌丝基因组DNA、RNA的提取和CDNA合成  162
      1.4 Psbadhl基因克隆、载体构建及序列分析  162
      1.5 大豆疫霉的转化  162-163
      1.6 致病性测定  163
      1.7 大豆疫霉菌株对NaCl的耐受性  163
      1.8 大豆疫霉PsBADHl酶活性测定  163
      1.9 Southern杂交  163-164
      1.10 Psbadhl的转录水平分析  164
    2 结果与分析  164-170
      2.1 Psbadhl基因克隆  164-165
      2.2 Psbadhl基因序列分析  165
      2.3 Psbadhl的转录水平分析  165
      2.4 Psbadhl参与应对盐胁迫  165-167
      2.5 PSBADHl具有BADH酶活性  167-170
    3 讨论  170-171
    参考文献  171-173
附录  173-180
攻读博士学位期问发表的研究论文  180-182
致谢  182

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 大豆病虫害
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