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猪圆环病毒2型致病机理和重组腺病毒介导shRNA抑制PCV2在体内外复制的研究

作　者: 冯志新
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PCV2 致病机理 重组腺病毒 RNA干扰
分类号: S858.28
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


猪圆环病毒2型（PCV2）为圆环病毒科成员之一，在全球各地已广泛流行，可引起多种临床疾病，包括是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），猪皮炎和肾病综合征，已给世界养猪业造成巨大经济损失。该病毒与其它细菌或病毒（如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒）发生混合感染，则能引起更严重的疾病。其致病机理研究尚不十分清楚，在我国也尚无有效控制措施。本研究从我国不同地方PCV2流行毒株的分子遗传特性、PCV2与PRRSV共感染对猪肺泡巨噬细胞的免疫功能两方面探讨其致病机理，并利用腺病毒介导shRNA技术探讨该病防治的新策略，为我国有效防治该病奠定基础。1．中国PCV2流行毒株遗传特性研究。我们收集了2002-2004年全国9个省市具有PMWS临床症状的仔猪病料，分别通过病理学观察、病毒分离，并对不同来源和时间的毒株进行全基因测序及序列分析。结果为，11株PCV2的全序列核苷酸同源性为95.1-99.7％，与GenBank中来源于不同地区、不同时间和不同疾病的49株PCV2序列进行分析比较，全基因核苷酸同源性为93.5-99.70％，ORF2核苷酸同源性为89.9-99.9％。其中与来源于健康猪群的PCV2比较，全基因核苷酸同源性为94.3-99.7％，ORF2核苷酸同源性为89.3-99.7％；与来源于其它疾病（PDNS和流产）的PCV2全基因核苷酸同源性为94.5-99.6％，ORF2同源性为90.2-99.6％。；所有这60株PCV2的系统发生树由两个大分支构成；中国PCV2毒株在两个分支上均有分布。结果证实，PCV2感染及PMWS的发生在我国猪群中已相当普遍；中国PCV2序列与其它国家的毒株均有很近的亲缘关系，但其中大部分与欧洲的毒株同源性较高；中国各地的PCV2存在多种基因型，流行毒株分子遗传特性无时间和地域性差异。基因的差异与临床症状无明显联系。病毒致病特性与病毒分子遗传变异可能无直接相关性。2．PCV2与PRRSV混合感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响。我们首先成功建立了PCV2、PRRSV以及猪几种细胞因子（INFα，INFγ，TNFα，IL-8和IL-10）的实时定量PCR检测方法，然后制备猪肺泡巨噬细胞（PAM），再将PAM细胞分为6组，分别接种PRRSV和PCV2，即PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV（先接种PCV2,12h后接种PRRSV）、PRRSV+PCV2（先接种PRRSV，12h后接种PCV2）、PRRSV／PCV2（同时接种）和Mock组。接种后培养不同时间观察细胞病变和存活率，并用Real-time PCR和IFA方法检测PAM中PRRSV和PCV2的滴度、以及细胞因子INFα、INFγ、TNFα、IL-8和IL-10的mRNA水平。结果为：①PRRSV能在PAM中增殖，并产生CPE；PCV2在PAM中感染率较低，无CPE。②PRRSV对PCV2增殖没有明显影响，而PCV2先于或同时与PRRSV感染对PRRSV的复制具有抑制作用，但PCV2后于PPRSV感染，可促进PRRSV增殖。③PCV2单独感染PAM后能促进INF-α和INF-γ的大量表达；PRRSV单独感染PAM初期，INF-γ表达量增加，INF-α表达量减少，感染后期INF-α的表达量才有所上升。PCV2与PRRSV混合感染初期则使INF-α和INF-γ表达减少，感染48h后，INF-α的表达量迅速上升，并维持在较高的水平，INF-γ虽然有所上升，但始终维持在较低的水平。④PCV2单独感染对TNF-α的表达量影响不大；而PRRSV感染后，TNF-α表达量持续增加，尤其是与PCV2混合感染后，TNF-α的表达量明显增加。⑤PCV2与PRRSV单独感染后均可以刺激IL-8和IL-10大量表达，感染初期IL-8的表达量高，随后下降，但IL-10的表达量一直维持在很高的水平。PRRSV+PCV2组与PCV2／PRRSV组IL-8和IL-10的平均表达量均明显增加。上述结果表明，PRRSV与PCV2体外共感染对PCV2的增殖没有明显影响，PRRSV感染后如果再感染PCV2，可以明显促进PRRSV病毒增殖，抑制体液免疫和细胞免疫，同时，两种病毒共同刺激了TNF-α、IL-8和IL-10的大量表达，抑制了抗病毒因子INF-γ的表达，从而加重了病理学免疫应答，促进了病理损伤。3．腺病毒介导shRNA在体内外抑制PCV2复制机理研究。（1）靶向PCV2 ORF1和ORF2 shRNA重组腺病毒的构建。首先，我们设计合成分别针对PCV2 ORF1与ORF2基因的发夹小RNA片段（shRNA）S1与S2，分别体外退火形成双链，克隆入pSUPER载体中的H1启动子后的克隆位点，再将H1启动子连同小RNA片段切下后插入重组腺病毒穿梭质粒（pAdTrack-CMV）的多克隆位点，与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组，获得的重组腺病毒质粒pAdS1与pAdS2经转染293A细胞生成表达针对PCV2 ORF1与ORF2的shRNA的重组腺病毒，分别命名为：rAdS1与rAdS2。我们用相同的方法将pSUPER载体中的H1启动子插入腺病毒表达载体，构建成功了对照重组腺病毒，rAdH1。（2）重组腺病毒介导的shRNA抑制PCV2在PK15细胞中复制的研究。将rAdS1、rAdS2和对照病毒rAdH1接种PK-15细胞，24h后再接种PCV2病毒，继续培养48h后，用间接免疫荧光试验检测PCV2，结果为，rAdS1和rAdS2均能有效地抑制PCV2病毒的增殖，其中rAdS2抑制效率更强，达96％。分别通过半定量PCR，实时定量PCR和Western blot方法检测上述试验中PCV2的mRNA、DNA和蛋白表达，结果表明，PCV2感染后48h，重组腺病毒rAdS1与rAdS2对PCV2在PK15细胞上的复制有明显的抑制作用，并至少持续120h，且这种抑制作用有重组腺病毒感染剂量依赖性，当表达shRNA重组腺病毒的接种剂量增加至1000个MOI时，rAdS1与rAdS2对PCV2的抑制效率分别升至78％和96％；将这两种重组腺病毒共同感染PK15细胞，发现对病毒复制的抑制作用具有相加性；而且用重组腺病毒接种已经感染PCV2的PK15细胞，病毒的复制也得到部分抑制，其中rAdS1与rAdS2对PCV2的DNA水平的抑制效率分别为48.8％和78.9％。（3）重组腺病毒介导的shRNA抑制PCV2在小鼠体内复制的研究。将重组病毒以108efu／只的剂量通过滴鼻与腹腔注射的方式接种BALB／c小鼠，24h后每只小鼠通过同样的接种方式感染104TCID50 PCV2。感染后观察小鼠的临床症状，并在第7、14，21和28天每组分别宰杀5只小鼠，观察肉眼病变，并通过实时定量PCR方法检测小鼠脾脏及血液中PCV2的病毒含量。结果显示，各组小鼠均未表现出明显的临床症状和肉眼病变。在阳性对照组（PCV2单感染组），小鼠感染PCV2后7-21天，脾脏内PCV2病毒的滴度逐渐增加。在试验组，重组腺病毒rAdS1和rAdS2在感染后前1-2周对小鼠脾脏中PCV2病毒均有轻微的抑制作用，到第3、4周这种抑制作用明显增强，对PCV2病毒的抑制效率可达91.4％-96.8％。结果表明，靶向PCV2基因组不同区域的shRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。

全文目录


摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-14
上篇 研究综述  14-58
  第一章 PCV2流行病学研究进展  14-28
    1. PCV的发现与分类地位  14-15
    2. PCV的分子生物学特征  15-18
      2.1 生物学特性与基因组结构  15-16
      2.2 编码蛋白与功能  16-18
    3. 流行病学  18-22
      3.1 PCV的全球流行情况  18-19
      3.2 PCV的遗传与进化  19-21
      3.3 PCV的传播及共公卫生学  21-22
    参考文献  22-28
  第二章 PCV2致病机理研究进展  28-45
    1. PCV2引起的疾病  28-31
    2. 致病机理  31-36
      2.1 病毒在体内的分布与复制  31-32
      2.2 病毒与机体免疫系统的相互影响  32-35
      2.3 PCV2与其它病原的相互作用  35-36
    3. 防治进展  36-38
    参考文献  38-45
  第三章 RNA干扰技术研究进展  45-58
    1. RNAi的发现  45
    2. RNAi的原理  45-47
    3. RNAi的特点  47-48
    4. RNAi的实验技术  48-51
      4.1 靶序列的选择  48
      4.2 SiRNA的获得  48-50
      4.3 SiRNA的导入  50-51
    5. RNAi的应用  51-53
      5.1 研究基因功能  51-52
      5.2 抗病毒与抗肿瘤  52-53
    6. RNAi的前景与问题  53-55
    参考文献  55-58
下篇 研究内容  58-168
  第四章 猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株分子遗传特性研究  58-76
    1 材料与试剂  59-60
    2 方法  60-61
    3 结果  61-63
      3.1 临床症状与病理学  62
      3.2 PCV2检测及全基因序列扩增  62
      3.3 序列分析  62
      3.4 基因进化树分析  62-63
      3.5 病毒的分离与鉴定  63
    4. 讨论  63-73
    参考文献  73-76
  第五章 猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立  76-86
    1 材料与方法  77-78
    2 结果  78-79
      2.1 敏感性  78
      2.2 特异性  78-79
      2.3 重复性  79
      2.4 与常规PCR的比较  79
      2.5 PMWS临床样品的检测  79
    3 讨论  79-83
    参考文献  83-86
  第六章 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒SYBR Green实时RT-PCR检测方法的建立  86-95
    1 材料与方法  86-89
    2 结果与分析  89
      2.1 特异性  89
      2.2 敏感性  89
      2.3 重复性  89
      2.4 PRRS疑似猪组织样品的检测  89
    3 讨论  89-93
    参考文献  93-95
  第七章 猪细胞因子SYBR Green实时RT-PCR检测方法的建立  95-105
    1 材料与方法  96-97
    2 结果与分析  97-98
      2.1 特异性  97
      2.2 敏感性  97
      2.3 重复性  97
      2.4 外周血淋巴细胞中细胞因子的检测  97-98
    3 讨论  98
    4 结论  98-102
    参考文献  102-105
  第八章 PRRSV与PCV2体外共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响  105-121
    1 材料与方法  106-108
    2 结果  108-109
      2.1 PAM细胞变病与存活率检测  108
      2.2 PCV2检测  108
      2.3 PRRSV检测  108
      2.4 INF-α和INF-γ mRNA定量检测  108-109
      2.5 IL-8和IL-10 mRNA定量检测  109
      2.6 TNF-α mRNA定量检测  109
    3. 讨论  109-118
    参考文献  118-121
  第九章 靶向PCV2 ORF1和ORF2 shRNA的重组腺病毒的构建与鉴定  121-139
    1 材料与方法  122-129
    2 结果  129-130
      2.1 重组pSUPER质粒的酶切鉴定  129
      2.2 重组pSUPER质粒的序列测定  129
      2.3 重组穿梭质粒的构建与鉴定  129
      2.4 腺病毒重组质粒的构建与鉴定  129
      2.5 重组腺病毒的收获与滴度测定  129-130
      2.6 重组腺病毒的鉴定  130
    3 讨论  130-137
    参考文献  137-139
  第十章 重组腺病毒介导的shRNA抑制PCV2在PK15细胞中复制  139-159
    1 材料与方法  140-143
    2 结果  143-145
      2.1 半定量RT-PCR反应条件的确定  143
      2.2 重组腺病毒感染PK15细胞条件优化  143
      2.3 重组腺病毒抑制PCV2在PK15细胞上的复制  143-144
      2.4 重组腺病毒抑制PCV2复制具有剂量依赖性  144
      2.5 重组腺病毒抑制PCV2复制的持续性  144
      2.6 重组腺病毒抑制PCV2复制的协同性  144
      2.7 重组腺病毒表达的shRNA抑制PCV2 mRNA的转录  144-145
      2.8 重组腺病毒表达的shRNA抑制PCV2蛋白的合成  145
      2.9 重组腺病毒表达的shRNA抑制PCV2 DNA的复制  145
      2.10 重组腺病毒清除PK-15细胞中的PCV2  145
    3 讨论  145-155
    参考文献  155-159
  第十一章 重组腺病毒介导的shRNA抑制PCV2在小鼠体内复制  159-168
    1 材料与方法  160-161
    2 结果  161
      2.1 临床症状与肉眼病变的观察  161
      2.2 组织中病毒含量的检测  161
      2.3 病毒血症的检测  161
    3 讨论  161-165
    参考文献  165-168
全文总结  168-169
致谢  169-170
攻读学位期间发表的论文  170

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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