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胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1表达上调及氨基酸平衡的维持参与大鼠脑缺血预处理的脑保护作用

作　者: 张敏
导　师: 李文斌
学　校: 河北医科大学
专　业: 生理学
关键词: 四血管闭塞全脑缺血模型脑缺血预处理脑缺血耐受海马 GLT-1 GFAP 氨基酸微透析高效液相色谱
分类号: R743
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

实验发现,给动物突然造成较严重的脑缺血,海马CA1区的神经元会大量死亡。若在此之前,预先给动物造成轻微、短时、不至于引起神经元死亡的脑缺血,可保护神经元,使其能够耐受在该轻微脑缺血后给予的通常会引起神经元严重损伤的较严重脑缺血。预先给予的轻微、短时脑缺血称为脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP),所产生的这种保护作用称为脑缺血耐受(brain ischemic tolerance, BIT)。自1990年Kitagawa首先发现这一现象以来,大量研究证实了它的存在。阐明CIP脑保护作用的机制,对临床上研究、开发提高神经元对缺血缺氧耐受性的治疗方法具有重要意义。大量研究表明,严重脑缺血缺氧可导致脑内谷氨酸等兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs)的浓度异常升高,从而产生兴奋性神经毒作用。细胞膜上的高亲和性兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporters, EAATs)可将兴奋性氨基酸从突触间隙转运至细胞内,在及时终止兴奋性突触传递以及维持细胞外液兴奋性氨基酸的正常水平中发挥重要作用。目前已发现五种高亲和性EAATs,包括EAAT1 (又称为glutamate/aspartate transporter, GLAST)、EAAT2 (又称为glail glutamate transporter-1, GLT-1)、EAAT3 (又称为excitatory amino acid carrier 1, EAAC1)、EAAT4和EAAT5。一般认为,GLAST和GLT-1为胶质细胞转运体,主要分布在星型胶质细胞;EAAC1、EAAT4和EAAT5为神经元转运体,其中EAAC1主要分布在海马神经元,EAAT4主要分布在小脑神经元,EAAT5主要分布在视网膜。EAATs主要由钠、钾离子浓度梯度驱动转运。当离子梯度降低或膜电位降低时,如缺血、癫痫发作时,EAATs摄取EAAs的功能减弱,甚至可以将细胞内的谷氨酸反向转运至细胞外,导致细胞外谷氨酸浓度异常升高,而产生神经毒作用。尽管神经元和胶质细胞都表达EAATs,但是普遍认为胶质细胞的EAATs对谷氨酸的转运能力比神经元要强大的多,尤其是星形胶质细胞谷氨酸转运体亚型GLT-1在调节细胞外液谷氨酸浓度方面发挥主要作用。据此,我们推测,GLT-1可能在脑缺血耐受诱导过程中发挥作用。然而,到目前为止,仅有的几篇关于GLT-1是否在脑缺血耐受诱导过程中发挥作用的研究均为离体实验,且所得结果互相矛盾。为了探讨GLT-1是否在脑缺血耐受诱导过程中发挥保护作用,本实验应用脑组织病理学、免疫组织化学、western blot分析、脑内微透析以及高效液相色谱等方法,研究了在体(in vivo)脑缺血耐受诱导过程中大鼠海马GLT-1和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达以及谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸以和γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA)浓度的变化。1 CIP诱导大鼠海马CA1区GLT-1和GFAP蛋白表达上调采用大鼠四血管闭塞(4 vessel occlusion, 4VO)全脑缺血模型,应用脑组织病理学评价、免疫组织化学以及western blot分析等方法,观察脑缺血耐受诱导过程中大鼠海马CA1区GLT-1和GFAP蛋白表达的变化,探讨GLT-1在脑缺血耐受诱导过程中的作用。1.1脑组织病理学评价145只大鼠随机分为以下5组。①正常对照组(n=5);②凝闭椎动脉组(n=35):凝闭双侧椎动脉;③CIP组(n=35):全脑缺血3 min;④损伤性脑缺血组(n=35):全脑缺血8 min;⑤CIP+损伤性脑缺血组(n=35):CIP后2天全脑缺血8 min。除正常对照组之外,其余各组根据动物末次手术后取材时间,分为0 h(即刻)、3 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d共7个亚组(每个时间点n=5)。各组动物均于预定时间点取脑,连续切片,硫堇染色下观察海马CA1区迟发性神经元死亡(delayed neuronal death, DND)情况。根据以下标准确定组织学分级(Histological grade, HG):0级,无神经元死亡;Ⅰ级,散在神经元死亡;Ⅱ级,成片神经元死亡;Ⅲ级,几乎全部的神经元死亡。计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体神经元的数目,每张切片双侧海马各计数3个区段,取平均数为神经元密度(Neuronal density, ND)。硫堇染色显示,正常对照组大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐致密,可见2～3层,细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富,胞核大而圆、核仁清晰, HG为0级, ND为210±5.7。凝闭椎动脉组大鼠各时间点海马CA1区均未见明显损伤,与control组相比,HG、ND均无明显变化。CIP组大鼠在各时间点海马CA1区均未见明显损伤,与凝闭椎动脉组大鼠相应时间点相比,HG、ND均无明显变化。损伤性脑缺血组大鼠在2天内未见明显的锥体神经元损伤;3天时可见部分神经元死亡,细胞形态发生明显改变,可见胞体缩小,形态不规则,呈多角型或梭型,胞膜皱缩,胞核固缩、浓染,核仁模糊不清或消失,突起明显深染变长;至损伤性脑缺血后5 d和7 d时,神经元几乎全部死亡,与凝闭椎动脉组大鼠相比,HG明显升高,ND明显减少。CIP+损伤性脑缺血组大鼠在各时间点海马CA1区锥体细胞排列整齐致密,胞核饱满,核仁较清晰,仅个别锥体细胞胞核固缩,无明显细胞缺失,与损伤性脑缺血后7 d组相比,HG明显降低,ND明显升高(p<0.01)。这些结果表明,CIP对2天后发生的严重脑缺血再灌注损伤有明显的对抗作用,表明脑缺血耐受诱导成功。1.2免疫组织化学检测动物分组及实验程序与上述脑组织病理学评价相同。GLT-1免疫组织化学染色显示,对照组可见在海马CA1区有一定量GLT-1阳性标记物。凝闭椎动脉组几乎各时间点均可以见到GLT-1明显上调,以3h点表达最高,并且隐约可以见到胶质细胞样轮廓。CIP组与凝闭椎动脉组各相应时间点比较,早期明显上调,以1d时较为明显;另外可见在环绕锥体细胞的周围区域,GLT-1表达有所上调,形成一定的“网格”状。与凝闭椎动脉组相比,损伤性脑缺血组各相应时间点GLT-1的表达均下调,尤其以死亡的锥体细胞周围下调的最为明显,甚至表现为GLT-1大片缺失。CIP+损伤性脑缺血组大鼠与损伤性缺血组相比,各相应时间点GLT-1均明显上调,GLT-1阳性标记物紧紧包绕在锥体细胞周围,并形成明显的“网格”状。GFAP免疫组化染色显示形态完整的星形胶质细胞呈星形或蜘蛛状,有明显的突起。control组海马CA1区可见星形胶质细胞散在均匀分布。凝闭椎动脉组与control组相比,所有时间点GFAP阳性标记物均明显减少。CIP与凝闭椎动脉组相比,CA1区星形胶质细胞的突起有所延长,在环绕锥体细胞的周围区域可见一定程度的GFAP免疫颗粒分布;GFAP阳性细胞数、总面积、平均光密度均明显上调(P<0.01),以1~3天较为明显。损伤性脑缺血组海马CA1区GFAP阳性细胞数目明显增多,胞体肥大,突起变长、增粗,但并不包绕锥体神经元胞体;GFAP阳性细胞数、总面积、平均光密度均显著升高(P<0.01);上述变化在损伤性脑缺血后3 d和5 d最为明显。CIP+损伤性脑缺血组,海马CA1区GFAP阳性细胞胞体并不明显增大,但突起明显延长并环绕锥体神经元胞体,形成非常明显的网格状;上述变化在损伤性脑缺血后2 d达高峰,一直持续至7 d。1.3 western blot分析205只大鼠随机分为以下6组:①正常对照组(n=5);②sham组(n=20):根据sham手术后取材时间,分为0 h(即刻)、3 h、12h、2d共4个时间点(每个时间点n=5);③椎动脉凝闭组(n=45);④CIP组(n=45);⑤损伤性脑缺血组(n=45);⑥CIP+损伤性脑缺血组(n=45)。除正常对照组及sham组之外,其余各组根据动物末次手术后的取材时间,分为0 h(即刻)、3 h、6h、12h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d共9个亚组(每个时间点n=5)。Sham组动物暴露椎动脉和颈总动脉,但不阻断其血流。其余各组动物的处理与1.1相同。GLT-1的western blot分析显示,与对照组相比,凝闭椎动脉组GLT-1的表达在多个时间点明显上调,第一次高峰在3 h和6 h,第二次高峰在5 d,以3 h最高。与sham组相比,凝闭椎动脉组GLT-1的表达在即刻、3 h、2 d均显著升高,表明凝闭椎动脉后GLT-1的表达上调不是麻醉和手术导致的,而是凝闭椎动脉所引起的。CIP组中,与CIP后即刻或凝闭椎动脉组相比,除CIP后3 h、3 d GLT-1的表达明显下调外,其余各时间点GLT-1的表达均显著上调(P<0.05)。损伤性脑缺血组中,与该组的即刻时间点、或凝闭椎动脉组相比,除损伤性缺血后12 h外,其余所有时间点GLT-1的表达均下调。CIP+损伤性脑缺血组中,与该组的即刻取材时间点相比,GLT-1的表达在3 h、12 h明显上调;与损伤性脑缺血组相比,除1 d之外,其余各时间点GLT-1的表达均显著上调。GFAP的western blot分析显示,与对照组相比,凝闭椎动脉组GFAP的表达于各时间点均明显下调。与对照相比,sham组所有时间点GFAP的表达均未见明显的变化。凝闭椎动脉组与sham相比,GFAP的表达在即刻、12 h、2 d均显著减少,表明凝闭椎动脉后GFAP的表达下调不是麻醉和手术导致的,而是凝闭椎动脉所引起的。CIP组中,与该组的即刻时间点相比,CIP后GFAP的表达在12 h、7 d明显上调;与凝闭椎动脉组相比,CIP后GFAP的表达在所有时间点均明显升高。损伤性脑缺血组中,与该组的即刻时间点相比,损伤性脑缺血后GFAP蛋白的表达在3 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d均明显上调;与凝闭椎动脉组相比,损伤性脑缺血后GFAP的表达除即刻时间点之外,其余所有时间点均明显升高。CIP+损伤性脑缺血组中,与该组的即刻时间点相比,GFAP蛋白的表达在3 h、2 d、5 d、7 d明显上调;与损伤性脑缺血组相比,CIP+损伤性缺血后GFAP的表达在即刻时间点明显升高,3 h、1 d、7 d明显降低,其于各时间点无明显差异。以上结果表明:3 min CIP在对抗8 min缺血打击引起的DND的同时,可引起海马CA1区星形胶质细胞的突起延长、包绕锥体神经元,并且表达大量的GLT-1,提示CIP引起的GLT-1表达上调参与CIP的脑保护作用。2大鼠脑缺血耐受诱导过程中海马CA3区及齿状回GLT-1和GFAP蛋白表达的变化模型制备、动物分组、实验程序及实验方法与第一部分相同。采用神经元死亡率(死亡神经元数目与该区域神经元总数目之比)表示CA3区及齿状回的DND。2.1神经病理学评价与海马CA1区不同,全脑缺血打击后,仅个别动物海马CA3区和齿状回出现了少量锥体细胞或颗粒细胞的DND,细胞缺失率不超过20%。预先给予CIP,同样可防止上述DND的发生。其余各组的变化与CA1相同。由此可见,海马CA3区和齿状回的神经元对缺血的耐受能力较强,CIP对这些神经元同样具有保护作用。2.2 GLT-1和GFAP蛋白的表达海马CA3区及齿状回GLT-1、GFAP蛋白的表达与海马CA1区有所不同。在正常对照组海马CA3区和齿状回,特别是CA3区即可见较多的星型胶质细胞的突起伸入锥体神经元层,并且围绕在锥体神经元周围,同时在锥体神经元之间的区域可以见到一定量的GLT-1免疫阳性颗粒;单纯凝闭椎动脉,即可使这些免疫阳性颗粒明显增多,形成了较为明显的“网格”现象;8 min全脑缺血打击后,大部分区域,特别是锥体神经元之间的部位的GLT-1和GFAP的表达进一步增强,使其所形成的锥体细胞层内的“网格”现象更为明显。但CA3及齿状回的个别神经元缺失区的GLT-1和GFAP的表达下降;单纯CIP以及CIP+脑缺血打击后,海马CA3区和齿状回GLT-1和GFAP的表达与CA1区相类似,但GLT-1和GFAP表达的上调及其所形成的“网格”现象更为明显。这些现象提示,海马CA3区和齿状回GLT-1的基础表达较高,并且受到缺血刺激时,GLT-1的反应性表达上调更显著。这些特点可能是海马CA3区和齿状回对缺血耐受性较强的原因之一。3大鼠脑缺血耐受诱导过程中海马CA1区氨基酸浓度的变化应用清醒动物脑内微透析和高效液相色谱技术,分析大鼠脑缺血耐受诱导过程中海马CA1区细胞外液中谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)浓度的变化,探讨氨基酸平衡的变化在脑缺血耐受诱导中的作用。24只大鼠随机分为4组(n=6):①凝闭椎动脉组;②CIP组;③损伤性脑缺血组;④CIP+损伤性脑缺血组。各组模型的制备与1.1相同。各组动物均在清醒状态下行背侧海马CA1区微透析。按预定程序收集透析液,高效液相色谱法测定透析液中上述氨基酸的浓度。各组动物于微透析结束后,常规饲养7天,断头取材行脑组织病理学评价,确定微透析探头的位置和海马CA1区组织病理学改变。脑组织病理学观察显示,微透析探头被准确地植入了每例大鼠的背侧海马CA1区。除8 min脑缺血打击引起了海马CA1区几乎全部锥体神经元死亡之外,其余各组均未见到明显的神经元损伤。上述结果与我们以前的研究结果相一致。在VAO组的所有透析标本之间,未观察到谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸及GABA浓度的明显变化。3分钟的全脑缺血引起谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸及GABA浓度迅速升高,分别达到其正常对照水平的1.5、2、1.9和2.3倍,随着血液再灌注,其浓度迅速降至正常水平。8分钟的全脑缺血引起谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸和GABA浓度迅速升高。甘氨酸和GABA的升高呈单峰、出现于脑缺血打击末,峰值为其正常对照水平的3~4倍,再灌注后很快恢复至对照水平。而谷氨酸和门冬氨酸的升高呈双峰状,其第一个高峰出现的时相及幅度与甘氨酸和GABA相似;第二个峰分别出现于再灌注后7分钟和19分钟,其峰值较第一个峰更高,分别为其正常对照水平的5~7倍。CIP+损伤性脑缺血组中,谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸及GABA的浓度呈单峰状升高,于损伤性脑缺血末达到峰顶,分别为其自身对照水平的1.7、2.5、7和4倍,再灌注后迅速降低至正常水平,并持续到实验结束。上述结果表明,缺血打击引起谷氨酸、门冬氨酸与GABA之间失衡;CIP可防止缺血打击所引起的谷氨酸、门冬氨酸与GABA之间的失衡,提示CIP所诱导的脑缺血耐受可能与其防止脑缺血打击引起的氨基酸失平衡有关。此外,我们还对四血管闭塞法大鼠全脑缺血模型的制备进行了进一步探讨,发现凝闭双侧椎动脉本身也具有脑缺血预处理样作用,能够在一定程度上减轻其后48 h内较严重的全脑缺血所造成的损伤;椎动脉经寰椎的横突孔进入寰椎,行经寰椎内的翼状管,经翼状孔内口进入椎管。4结论(1) CIP引起大鼠海马CA1区星形胶质细胞的突起延长,伸入到锥体神经元之间并包绕锥体神经元,这些延长的突起上表达大量的GLT-1,此变化可以保护锥体神经元,使其能够耐受较严重的、通常会导致锥体神经元迟发性死亡的缺血打击。(2)大鼠海马CA3区和齿状回的神经元对缺血的耐受能力较强,可能与该区GLT-1和GFAP的基础表达较高,以及受到缺血刺激时反应性表达上调更明显有关。这些发现进一步说明了GLT-1在BIT诱导中的作用。(3)脑缺血打击引起大鼠海马CA1区谷氨酸、门冬氨酸与GABA之间失衡;CIP可通过防止缺血打击引起谷氨酸、门冬氨酸与GABA之间的失衡,从而诱导脑缺血耐受。

全文目录

中文摘要  4-11
英文摘要  11-22
英文缩写  22-24
研究论文 The up-regulated expression of GLT-1 and maintained balance of amino acids in extracellular fluid participated in the induction of brain ischemic tolerance in rats  24-160
  INTRODUCTION  24-26
  第一部分 The up-regulation of GLT-1 and GFAP in the hippocampal CA1  subfield during the induction of brain ischemic tolerance in rats  26-66
    前言  26-28
    材料与方法  28-36
    结果  36-42
    附图  42-56
    附表  56-57
    讨论  57-61
    小结  61
    参考文献  61-66
  第二部 Changes in the expression of GLT-1 and GFAP in the hippocampal CA3 subfield and dentate gyrus during the induction of brain ischemic tolerance in rats  66-100
    前言  66-67
    材料与方法  67-68
    结果  68-74
    附图  74-96
    讨论  96-98
    小结  98-99
    参考文献  99-100
  第三部分 The association of extracellular amino acid concentrations with the induction of brain ischemic tolerance in the rat CA1 hippocampus  100-140
    前言  100-101
    材料与方法  101-108
    结果  108-114
    附图  114-128
    附表  128-131
    讨论  131-134
    小结  134
    参考文献  134-140
  第四部分凝闭双侧椎动脉预处理对大鼠全脑缺血损伤的防护作用  140-154
    前言  140
    材料与方法  140-143
    结果  143-146
    附图  146-148
    附表  148-151
    讨论  151-152
    小结  152
    参考文献  152-154
  第五部分大鼠寰椎的解剖特点及其内椎动脉的走行  154-159
    前言  154
    材料与方法  154-155
    结果  155-156
    附图  156-157
    讨论  157
    小结  157-158
    参考文献  158-159
  结论  159-160
综述  160-187
致谢  187-188
个人简历  188-190

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