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脑缺血耐受诱导过程中大鼠海马CA1区谷氨酸转运体GLT-1b mRNA的表达

作　者: 梁翠娟
导　师: 张敏
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 脑缺血耐受 GLT-1b mRNA 原位杂交 PT-PCR 大鼠
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：脑缺血性疾病是严重危害着当代人类健康的常见疾病。众所周知,大脑神经元对缺血性损害极为敏感,经过一定时间的缺血后,神经元会大量死亡,因此如何提高神经元对缺血性损害的抵抗力,以保证积极疏通血管、恢复血流供应后神经元仍具有正常功能,具有很重要的现实意义。实验发现,给动物突然造成较严重的脑缺血后,海马CA1区的神经元会大量死亡。若在此以前,预先给动物造成轻微、短时、不至于引起神经元死亡的脑缺血,间隔一定时间后,再给此动物造成较严重的会引起大量神经元死亡的脑缺血,此时海马CA1区神经元基本不死亡,即神经元对缺血性损害产生了抵抗力。这一现象被称为脑缺血耐受,预先给予的轻微、短时脑缺血称为脑缺血预处理。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内一种主要的兴奋性神经递质,由于胞外没有谷氨酸代谢酶,中枢神经系统细胞外液中谷氨酸的稳态主要由兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transports, EAATs)来维持。生理情况下,EAATs转运细胞外的谷氨酸进入细胞内,降低其在突触间隙的浓度,在及时终止突触传递以及防止谷氨酸受体过度兴奋中发挥重要作用。到目前为止,发现并克隆了5种高亲和性EAATs即GLAST (EAAT1)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1 (EAAT3)、EAAT4和EAAT5。尽管在神经元和星形胶质细胞上都存在EAATs,但是星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力远远高于神经元,而且在很多脑区最主要的谷氨酸转运体是EAAT2(GLT-1)。脑缺血时,细胞外液中的谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常升高,从而造成细胞损伤,因而其又被称为兴奋性神经毒素。如何降低脑缺血时细胞外液谷氨酸浓度,以减轻对神经元的损伤,是目前研究的热点之一。我们的前期实验已经证明,脑缺血预处理可使星形胶质细胞突起延长,并且紧紧环绕锥体神经元,同时表达大量的GLT-1,并使谷氨酸的摄取增强；损伤性缺血可导致GLT-1表达下调,尤其在死亡的锥体细胞周围下调的最为明显,甚至表现为大片的GLT-1表达缺失；应用GLT-1抑制剂DHK抑制GLT-1的功能、或应用GLT-1的反义寡核苷酸减少GLT-1的表达,均可抑制脑缺血预处理的脑保护作用。这些研究结果表明,GLT-1参与整体情况下脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。最近有研究报道,GLT-1存在剪接变异体。到目前为止,已发现大鼠GLT-1的剪接变异体共有4种,其中3种为C末端剪接变异体,1种为N末端剪接变异体(rGLT-1A)。3种C末端剪接变异体分别被命名为GLT-1a(又名GLT-1α)、GLT-1b(又名GLT-1v)以及GLT-1c (Rauen et al 2004)。在大鼠脑组织中GLT-1c表达量很低,不存在于神经元,仅仅局限于血管周围的星形胶质细胞的终足,以及第三脑室和侧脑室附近的星形胶质细胞。GLT-1a和GLT-1b在大鼠的脑组织中表达丰富,包括海马在内的广泛脑区的神经元和星形胶质细胞均表达GLT-1a和GLT-1b。在一些病理情况下,GLT-1的剪接变异体的表达可发生变化。但是究竟GLT-1的何种剪接变异体在脑缺血耐受诱导过程中发挥作用还不清楚。所以我们欲探讨GLT-1b在脑缺血耐受诱导过程中是否发挥作用。方法：健康雄性Wistar大鼠135只,体重280-320g,随机分为5组。除control组之外,其余大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行sham手术或脑缺血处理,具体分组如下：①control组(n=3)；②sham组(n=33)：只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流；③脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP)组(n=33)：夹闭双侧颈总动脉3 min后恢复再灌注；④损伤性缺血(ischemic insult,Ⅱ)组(n=33)：夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注；⑤脑缺血预处理+损伤性缺血(CIP+Ⅱ)组(n=33)：夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。除control组之外,其余各组分别于末次手术后0min、30min、1h、3h、6h、1d、2d、3d、5d、7d时取海马脑组织(每个时间点n=3)。左侧海马制成5μm厚的石蜡切片用于以下实验：1硫堇染色进行神经病理学评价；2原位杂交检测GLT-1b mRNA的表达。右侧海马通过RT-PCR法观察GLT-1b mRNA的表达数量。结果：1神经病理学评价硫堇染色显示,control组大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐致密,可见2-3层,细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富,胞核大而圆、核仁清晰,ND为203±9.7。Sham组大鼠各时间点海马CA1区均未见明显损伤,与control组相比,ND均无明显变化(P>0.05)。CIP组大鼠在各时间点海马CA1区均未见明显损伤,与sham组相应时间点相比,ND均无明显变化(P>0.05)。Ⅱ组在2天内未见明显的锥体神经元损伤；至损伤性脑缺血后5 d和7 d时,神经元几乎全部死亡,与sham组相比,ND明显减少(P<0.05)。CIP+Ⅱ组在各时间点海马CA1区锥体细胞排列整齐致密,胞核饱满,核仁较清晰,仅个别锥体细胞胞核固缩,无明显细胞缺失,与损伤性脑缺血后7 d组相比,ND明显升高(P<0.05)。这些结果表明,CIP对2天后发生的严重脑缺血再灌注损伤有明显的对抗作用,表明脑缺血耐受诱导成功。2原位杂交法观察GLT-1b RNA在海马CA1区的表达GLT-1b mRNA原位杂交染色显示形态完整的锥体神经元。Control组海马CA1区,神经元呈圆形,形态完整,边界隐约可见,胞浆着色,呈棕色,胞核基本不着色。Sham组锥体神经元胞浆着色明显,呈棕色,胞核在0min-6h着色较浅,其余时间点不着色。与control组相比,在0min、30min、1h、3h、6h、12h时间点GLT-1b mRNA表达的平均光密度、阳性标记物总面积均明显升高(P<0.05)；其余时间点GLT-1b mRNA表达的平均光密度、阳性标记物总面积均无明显差异(P>0.05)。CIP组神经元着色进一步加深,以3h、6h、12h较为突出,多数神经元几乎呈均匀一致的棕色,胞核与胞浆的界限不清；2d时间点,胞浆着色仍较深,但胞核基本不着色；此后神经元着色逐渐变浅。与sham组相比,GLT-1b mRNA表达的平均光密度在1h、3h、6h、12h、1d、2d时明显升高(P<0.05),阳性标记物总面积在3h、6h、12h、1d、2d明显升高(P<0.05),其余时间点无明显差异。Ⅱ组早期CA1区锥体神经元形态无明显改变,但神经元染色逐渐变浅；5d、7d时,锥体神经元几乎完全消失,在锥体神经元区出现胶质细胞侵润,该细胞较神经元体积小,呈圆形,染为棕色。与sham组相比,GLT-1b mRNA表达的平均光密度、阳性标记物总面积在12h、1d、2d时均明显降低(P<0.05)。CIP+Ⅱ组,早期神经元染色明显加深,胞核与胞浆的界限不清,在3h时间点最为突出(P<0.01)；2d时神经元染色以胞浆着色为主；此后神经元着色逐渐变浅。与Ⅱ组相比,GLT-lb mRNA表达的平均光密度、阳性标记物总面积均明显升高(P<0.05)。3 RT-PCR法观察GLT-lb mRNA在大鼠海马CA1区的表达数量Control组大鼠海马GLT-1b (?)nRNA有一定量表达。Omin、30min时间点：sham组与control组相比明显升高(P<0.05)；CIP组和Ⅱ组与sham组相比无明显差异(P>0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比明显升高(P<0.05)。1h、3h时间点：sham组与control组相比明显升高(p<0.05)；CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)；Ⅱ组与sham组相比略有降低,但差异无显著性(P>0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比明显升高(p<0.05)。6h时间点：sham组与control组相比明显升高(p<0.05)；CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)；Ⅱ组与sham组相比无明显差异(p>0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比明显升高(p<0.05)。12h、1d时间点：sham组与control组相比明显升高(p<0.05)；CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)；Ⅱ组与sham组及CIP组相比均明显降低(p<0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比明显升高(p<0.05)。2d时间点：sham组与control组相比无明显差异(p>0.05)；CIP组与sham组相比明显升高(p<0.05)；Ⅱ组与sham组及CIP组相比均明显降低(p<0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比明显升高(p<0.05)。3d、5d、7d时间点：sham组与control组相比无明显差异(p>0.05)；CIP组与sham组相比无明显差异(p>0.05)；Ⅱ组与sham组及CIP组相比均明显降低(p<0.05)；CIP+Ⅱ组与Ⅱ组相比均明显升高(p<0.05)。结论：1 8 min全脑缺血可以导致大鼠海马CA1区大量锥体神经元发生明显DND,而提前2天的3 min缺血预处理可以保护锥体神经元,使其能够耐受通常会引起明显DND的8 min损伤性缺血。2原位杂交显示,缺血预处理可使大鼠海马CA1区锥体神经元GLT-1b mRNA表达增多；RT-PCR显示,缺血预处理可使大鼠海马CA1区GLT-1bmRNA表达数量明显增多。该变化可能保护锥体神经元使其能够耐受随后的损伤性缺血打击,参与缺血预处理的脑保护作用。3 CIP+II组与Ⅱ组相比,原位杂交显示大鼠海马CA1区锥体神经元GLT-1b mRNA表达明显增多；同时RT-PCR也显示大鼠海马CA1区GLT-1b mRNA表达数量明显增多。该变化说明GLT-1b参与缺血预处理的脑保护作用。

全文目录


中文摘要  4-9
ABSTRACT  9-16
前言  16-17
材料与方法  17-25
结果  25-28
附图  28-43
讨论  43-45
参考文献  45-49
综述 溶质载体家族1的研究进展  49-60
  参考文献  54-60
致谢  60-61
个人简历  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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