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番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定

作　者: 蒙姣荣
导　师: 陈保善；李华平
学　校: 华南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 寄主因子基因克隆番茄烟草花叶病毒黄瓜花叶病毒
分类号: S436.412
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本研究克隆了支持烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)复制的番茄基因ToTOM3。该基因全长cDNA共有1267个核苷酸,包含一个含888个核苷酸的编码区、72个核苷酸的5′非编码区和307个核苷酸的3′非编码区,编码一个含295个氨基酸、推测是一种七次跨膜蛋白的分子量为34.4 kDa的蛋白质。ToTOM3与拟南芥一个RNA病毒寄主因子基因AtTOM3有76.9%的同源性,与番茄中支持CMV的寄主因子基因ToTOM1有58.6%的同源性。用部分基因组文库结合PCR的方法克隆了ToTOM3基因的全长转录区,共6885bp,包含11个外显子和10个内含子。11个外显子的长度依次为243、91、53、93、72、73、46、64、54、78和400bp。10个内含子的长度依次为2031、155、77、77、654、75、1274、80、333和862 bp。相对定量RT-PCR试验表明ToTOM3基因在番茄子叶期、5叶期、10叶期、结果期等4个生育期的茎、根、叶及结果期的花和果等组织中均有表达,而且表达量基本一致,说明ToTOM3属于组成型表达基因。将ToTOM3基因反义RNA和RNA干扰质粒通过农杆菌介导方法导入番茄,获得26株转基因番茄。Southern杂交表明,这26株转基因番茄的染色体中均携带单拷贝外源基因片段。所有的盆栽转基因番茄均能正常生长、开花和结果。分别用TMV和CMV对5-6叶期转基因番茄和非转基因番茄苗进行接种。用TMV接种10天后,非转基因番茄苗表现出斑驳症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,接种TMV的非转基因植株仍表现为斑驳症状,而转基因植株无任何症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中TMV均比非转基因对照明显减少,其中,A53中TMV的含量最低,仅相当于对照的7.0%,而A134和R(A)114所含的病毒量最高,相当于对照的52.6%。用CMV接种10天后,非转基因番茄表现出典型的花叶症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,非转基因番茄苗的叶片严重黄化,形成凹突不平的疱斑,而转基因植株仅表现出轻微的斑驳症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中CMV的含量均比非转基因对照明显减少。不同的转基因株系携带的病毒量有所差异,A25所含的CMV量仅为对照的12.4%,R(A)8为对照的58.1%。高抗TMV的转基因株系同时也高抗CMV。本研究证明,ToTOM3是TMV和CMV共同的寄主因子。同时,本研究也显示,通过抑制寄主因子的表达,可以创造出抗病毒的植物新种质。

全文目录

摘要  6-8
前言  8-13
1 番茄 ToTOM3 基因的克隆和序列分析  13-36
  1.1 材料与方法  14-23
    1.1.1 材料  14
      1.1.1.1 植物材料  14
      1.1.1.2 菌株与质粒  14
      1.1.1.3 酶、试剂盒和化学试剂  14
    1.1.2 培养基和常用溶液的配制  14
    1.1.3 常规分子生物学操作方法  14-23
      1.1.3.1 番茄总RNA 的提取纯化  14-15
      1.1.3.2 番茄总DNA 的提取  15-16
      1.1.3.3 3′RACE  16
      1.1.3.4 5′RACE  16-17
      1.1.3.5 PCR 反应  17
      1.1.3.6 PCR 产物的克隆  17
      1.1.3.7 DNA 片段的纯化  17-18
      1.1.3.8 载体的脱磷酸化处理  18
      1.1.3.9 突出DNA 片段末端的补平  18
      1.1.3.10 DNA 限制性内切酶反应  18-19
      1.1.3.11 DNA连接反应  19
      1.1.3.12 DNA的转化  19-20
      1.1.3.13 质粒的提取  20-21
      1.1.3.14 Southern 杂交  21-22
      1.1.3.15 菌落原位杂交  22
      1.1.3.16 相对定量RT-PCR  22-23
  1.2 结果与分析  23-34
    1.2.1 ToTOM3基因全长cDNA的克隆  23-27
      1.2.1.1 ToTOM3 基因3′端序列的克隆  23-24
      1.2.1.2 ToTOM3 基因5′端序列的克隆  24-25
      1.2.1.3 ToTOM3 基因全长cDNA 的序列  25-27
    1.2.2 ToTOM3 基因编码蛋白质的氨基酸序列分析  27-30
      1.2.2.1 ToTOM3 基因编码蛋白质的疏水区域和跨膜结构区域  27-28
      1.2.2.2 ToTOM3 基因的同源性分析  28-30
    1.2.3 ToTOM3 全长基因的克隆  30-33
      1.2.3.1 ToTOM3 全长基因5′端片段的获得  30-32
      1.2.3.2 ToTOM3 全长基因3′端片段的获得  32-33
    1.2.4 ToTOM3 基因的结构  33-34
      1.2.4.1 ToTOM3 基因的内含子和外显子  33
      1.2.4.2 ToTOM3 基因的启动子序列  33-34
    1.2.5 ToTOM3 基因的时空表达  34
  1.3 小结  34-36
2 ToTOM3 基因的功能鉴定  36-66
  2.1 材料与方法  38-43
    2.1.1 材料  38
    2.1.2 常规分子生物学操作方法  38
    2.1.3 番茄的遗传转化  38-40
      2.1.3.1 三亲结合法向农杆菌导入目的质粒  38-39
      2.1.3.2 无菌苗的获得  39
      2.1.3.3 Flamingo-Bill外植体的转化  39-40
    2.1.4 转基因植株的扩繁  40
    2.1.5 盆栽  40
    2.1.6 转基因番茄的分子生物学检测  40-42
      2.1.6.1 PCR 检测  40-41
      2.1.6.2 Southern 杂交检测  41-42
    2.1.7 转基因番茄的抗病鉴定  42-43
      2.1.7.1 磨檫接种法  42
      2.1.7.2 病毒相对含量的测定  42-43
  2.2 结果与分析  43-64
    2.2.1 反义RNA 表达质粒的构建  43-46
      2.2.1.1 反义RNA 表达质粒的构建策略  43-44
      2.2.1.2 番茄 ToTOM3 全长转录区的 PCR 克隆  44-45
      2.2.1.3 ToTOM3 基因反义 RNA 表达质粒  45-46
    2.2.2 RNAi表达质粒的构建  46-51
      2.2.2.1 RNAi 表达质粒pBIToT3R-A 的构建  47-49
      2.2.2.2 RNAi 表达质粒pBIToT3R-B 的构建  49-51
    2.2.3 将表达质粒导入农杆菌 EHA105  51
    2.2.4 转 ToTOM3 基因反义 RNA 和 RNAi 表达质粒的转基因番茄  51-55
    2.2.5 转基因番茄的分子生物学检测  55-58
      2.2.5.1 转基因番茄的 PCR 检测  55-56
      2.2.5.2 转基因番茄的 Southern 杂交分析  56-58
    2.2.6 转基因番茄对 TMV 和 CMV 的抗性  58-64
      2.2.6.1 症状表现  58-60
      2.2.6.2 转基因番茄内TMV 的相对含量  60-62
      2.2.6.3 转基因番茄内CMV的相对含量  62-64
    2.2.7 转基因番茄中ToTOM3基因转录水平与抗病性之间的关系  64
  2.3 小结  64-66
3. 讨论  66-71
  3.1 ToTOM3 基因  66
  3.2 保守的TOM 基因家族  66-67
  3.3 寄主因子—抗病毒基因工程中全新的标靶基因  67-69
  3.4 转基因番茄的抗病机制  69
  3.5 ToTOM3 在亚细胞结构上的定位  69-71
  3.6 ToTOM3 的在CMV 复制中的相对活性  71
4. 结论  71-72
致谢  72-74
参考文献  74-94
英文摘要  94-96
附录 A 文献综述正链 RNA 病毒与寄主植物的相互作用  96-116
附录 B ToTOM3 基因全长序列及其启动子序列  116-121
附录 C 常用培养基和溶液  121-122
附录 D 缩略词和英汉对照  122-123

番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定

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