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氯胺酮抗痛觉过敏机制的实验研究

作　者: 简道林
导　师: 田玉科
学　校: 华中科技大学
专　业: 麻醉学
关键词: 氯胺酮吗啡耐受神经病理性疼痛炎性疼痛内毒素 LPS NMDA受体拮抗剂痛觉过敏痛觉超敏星形胶质细胞
分类号: R614
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

氯胺酮抗痛觉过敏机制的实验研究研究背景组织和炎性损伤常引起痛觉过敏和痛觉超敏。研究表明,脊髓中枢性敏化与痛觉过敏的产生与维持密切相关,并认为痛觉过敏是脊髓背角中神经元级联反应的结果。尽管神经元模式能够较好地解释痛觉过敏的机制,然而近年来的研究发现,脊髓胶质细胞及其促炎性细胞因子与多种情况下痛觉过敏的产生和维持有关。皮下组织炎症、周围神经损伤、脊神经根结扎、脊髓免疫激活等因素均可以导致脊髓背角中的胶质细胞激活,激活的胶质细胞与其它免疫细胞一样,除释放活性氧、NO、PGs、EAA及其生长因子等兴奋痛觉反应神经元的物质外,还释放促炎性细胞因子IL-1、IL-6及其TNF,拮抗促炎性细胞因子能减轻痛觉过敏,而且,抑制胶质细胞激活的物质也能抑制上述因素所致的痛觉过敏。吗啡耐受引起痛觉过敏的机制被认为涉及到神经元的可塑性变化,有研究者认为吗啡耐受及其导致的异常疼痛敏感与神经病理性疼痛所导致的痛觉过敏和痛觉超敏在脊髓背角中存在着近乎相同的细胞学机制。外周神经损伤激活脊髓星形胶质细胞,既然吗啡耐受与神经病理性疼痛在脊髓背角的神经元细胞内机制有着相同的机制,那么吗啡耐受所导致的异常疼痛敏感也就可能与激活脊髓背角的胶质细胞有关。脑或脊髓中枢应用LPS,也促使动物出现痛觉过敏现象,但人们对中枢炎性痛觉过敏的机制尚了解得不够清楚。一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase,NOS)是合成NO的关键酶,NO在炎性和神经病理性痛觉过敏中起着重要作用,NO在伤害性反应机制中的作用成为许多研究者的课题。NMDA受体激活在痛觉过敏的中枢性敏化过程中发挥着重要作用,NO至少是NMDA受体激活后效应产生的中间介质之一。激活的胶质细胞也增加NO的合成,因此,促炎性细胞因子和NO可能在中枢炎症引起的痛觉过敏中发挥着重要作用。研究发现,NMDA受体拮抗剂MK-801和氯胺酮抑制吗啡耐受及其痛觉过敏。MK-801也能减轻神经损伤诱发的痛觉过敏,并抑制神经损伤导致的星形胶质细胞激活。氯胺酮是广泛应用于临床麻醉的非竞争性NMDA受体拮抗剂。有报道氯胺酮具有抗吗啡耐受所致的痛觉过敏和减轻神经病理性痛觉过敏效应,因此,有必要对其抗痛觉过敏的机制进行深入研究。本研究通过慢性脊髓吗啡耐受、L5脊神经切断及其鞘内注射LPS致中枢炎性痛觉过敏三种动物模型,观察氯胺酮对痛行为学、脊髓星形胶质细胞和促炎性细胞因子、NO/NOS的影响,进一步探讨氯胺酮抗痛觉过敏的效应与可能的机理。第一部分氯胺酮对吗啡耐受大鼠脊髓星形胶质细胞和促炎性细胞因子的影响目的观察非竞争性N-甲基D-天门冬氨酸受体拮抗剂氯胺酮与吗啡鞘内合用对吗啡耐受大鼠痛行为学、脊髓星形胶质细胞及其促炎性细胞因子的影响。方法实验动物27只SD雄性大鼠,体重170-250g,随机分为对照组(C组),吗啡耐受组(M组),氯胺酮+吗啡组(MK组),每组9只。采用腰背部切开,经腰5和腰6间隙置管,建立蛛网膜下腔给药途径。用BME-410A型热痛测试仪测定左后足跖缩足潜伏期,即间隔5min的3次测定平均值,表示大鼠对热伤害性刺激的敏感程度。Von Frey纤维丝刺左后足跖10次后,间隔5分钟再剌,三次共剌30次的缩足总数,反映大鼠的机械性痛觉超敏程度。置管后第4天的10 a.m.,C组、M组、MK组,分别经导管注射生理盐水、20μg吗啡、20 u g吗啡+250 u g氯胺酮,各组注射容量均为10μl,每天1次,连续5天。观察指标置管后第3天分别测定热伤害缩腿反应潜伏期(paw-withdrawal latency,PWL)和12gVon Frey30次刺激后的缩足总数。根据PWL计算最大镇痛效应百分比(percent of maximal possible effect,%MPE)。第1、3、5天上午10点钟鞘内注射药物后30 min测定PWL。第5天给药后24小时测定撤药后的PWL和缩足总数后,各组鞘内给予吗啡5μg/10μl行吗啡激发试验,接着再次测定PWL。随后,随机取4只大鼠腰段脊髓,采用SABC免疫组织化学方法检测各组脊髓背角星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性染色面积(average areas,AA)、平均光密度(the average opticaldensity,AOD)及积分光密度(the integral optical density,IOD)。取5只大鼠脊髓,ELISA法测定白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)含量。结果对行为学的影响C组、M组和MK组基础PWL值相近,分别为(9.31±0.90)s、(9.23±0.89)s及(9.19±0.28)s。第6天上午,距最后一次鞘内注射吗啡后24 h,C组的PWL与基础值接近,M组和MK组的PWL比基础值分别降低(2.71±0.20)s与(1.37±0.33)s(P<0.01),与基础值相比降低的百分比分别为29.44±2.12和14.89±2.85(P<0.01)。吗啡激发后的%MPE,C组(59.20±4.00%)分别显著高于M组(8.86±1.42%)(P<0.01)和MK组(21.32±3.92%)(P<0.01),而MK组又显著高于M组(P<0.01)。基础阳性缩足总数同为0.11±0.33次,吗啡激发试验前M组缩足阳性总数多达10.66±1.41次,显著多于MK组(5.22±1.22)(P<0.01)和C组(0.22±0.44)(P<0.01)。腰段脊髓星形胶质细胞的活化状态脊髓背角星形胶质细胞被吗啡激活而变肥厚。氯胺酮减轻星形胶质细胞被激活的程度。MK组脊髓胶质细胞的GFAP阳性表达产物相对面积(average area,AA)、平均光密度(average optic density,AOD)积分光密度(integral optical density,IOD)分别显著小于M组的对应值,提示氯胺酮抑制吗啡耐受大鼠脊髓背角胶质细胞的激活。腰段脊髓的IL-1β和IL-6以pg.mg protein-1为计量单位,M组的IL-1β(25.68±4.03)和IL-6(31.37±2.06)分别高于C组的IL-1β(9.18±2.65,P<0.01)和IL-6(12.97±1.84,P<0.01)。MK组的IL-1β(16.54±4.08)和IL-6(20.95±1.85)虽然显著高于C组,但却分别显著低于M组的对应数值。结论鞘内连续给予吗啡,可能导致大鼠对吗啡的抗伤害性作用减弱(吗啡耐受)和痛觉过敏与痛觉超敏。鞘内慢性给予吗啡,激活腰段脊髓后角星形胶质细胞,激活的胶质细胞释放促炎性细胞因子IL-1β和IL-6,可能参与吗啡耐受的形成机理。非竞争性NMDA受体拮抗剂氯胺酮与吗啡鞘内合用,均显示减轻吗啡耐受及其吗啡导致的痛觉敏感与痛觉超敏,提示NMDA受体与吗啡耐受及其痛敏的形成有关。鞘内吗啡与氯胺酮合用,抑制吗啡导致的大鼠腰段脊髓星形胶质细胞的激活,提示NMDA受体拮抗剂与调节剂可能对反复给予吗啡所致的胶质细胞激活有抑制作用。氯胺酮抑制鞘内吗啡耐受导致促炎性细胞因子IL-1β和IL-6的释放。第二部分氯胺酮对神经病理性疼痛大鼠脊髓促炎性细胞因子含量的影响目的观察氯胺酮对神经病理性疼痛大鼠痛行为学及脊髓促炎性细胞因子含量的影响。方法2.1实验动物SD雄性大鼠27只,体重170-250g,随机等分为三组,即假手术组,L5脊神经切断组,氯胺酮治疗组,每组9只。于切断L5脊神经当天,氯胺酮治疗组腹腔注射(i.p.)1ml氯胺酮(50mg.kg-1),假手术组和L5脊神经切断组腹腔注射1ml生理盐水。2h后,于硫贲妥钠(40mg.kg-1,i.p.)麻醉下,L5脊神经切断组和氯胺酮组切断左侧L5脊神经,建立神经病理性疼痛模型,假手术组仅行相应的手术操作而不切断L5脊神经。手术切断L5脊神经的次日记为手术后第1天,此后连续7天上午10点,氯胺酮治疗组50mg.kg-1氯胺酮稀释至1ml腹腔注射,假手术组和L5脊神经切断组则腹腔注射生理盐水1ml。2.2观察指标L5脊神经切断后第1、3、5、7天下午3点,各组分别测定PWL和12g Von Frey丝30次刺激后大鼠的阳性缩足总数。第8天上午10点,随机将5只大鼠断头处死后收集脊髓标本,ELISA法测定IL-1β和IL-6。结果疼痛行为学的变化L5脊神经切断后第1天,大鼠就开始出现热痛觉过敏和痛觉超敏,随着时间延长而越发明显。虽然氯胺酮治疗组的PWL也呈现逐渐缩短的趋势,且在L5脊神经切断后第3天、第5天及第7天明显低于对照组,但与L5脊神经切断组比较,氯胺酮治疗组L5脊神经切断后各观察时间点的PWL均显著为长。尽管L5脊神经切断后氯胺酮治疗组12gVon Frey 30次刺激阳性缩足总数较假手术组也明显增加,但L5脊神经切断组在L5脊神经切断后各观察时间点,均较氯胺酮治疗组的阳性缩足总数显著为多。腰段脊髓IL-1β和IL-6含量的变化以pg.mg protein-1为计量单位,L5脊神经切断组,无论是IL-1β(18.05±1.99)还是IL-6(23.65±2.76),其含量分别较氯胺酮治疗组的IL-1β(12.54±1.67,P<0.01)还是IL-6(16.01±0.93,P<0.01)和假手术组的IL-1β(9.25±0.80,P<0.01)还是IL-6(11.94±1.95,P<<0.01)显著升高。氯胺酮组的IL-1β和IL-6含量虽然也较假手术组增高(P<0.05),但却分别显著低于L5脊神经切断组。结论L5脊神经切断产生以热痛觉过敏和痛觉超敏为行为学特点的神经病理性疼痛,脊髓IL-1β和IL-6的含量明显增高。氯胺酮抑制L5脊神经切断诱发的痛觉过敏和机械性痛觉超敏,降低腰段脊髓IL-1β和IL-6的水平,可能与氯胺酮阻滞NMDA受体,抑制胶质细胞的激活有关。第三部分氯胺酮对鞘内注射LPS大鼠痛觉过敏和脊髓NO/NOS、IL-1βmRNA的影响目的观察氯胺酮对鞘内注射脂多糖(LPS)大鼠痛觉过敏和腰段脊髓NO/NOS、IL-1βmRNA表达的影响。方法实验动物SD大鼠30只,220-250g,雌雄各半,随机等分为空白对照组、LPS组和氯胺酮组。氯胺酮组鞘内给LPS 2h前,腹腔注射lml氯胺酮(30mg.kg-1),LPS组和空白对照组腹腔注射等量生理盐水。LPS组和氯胺酮组每鼠0.1mg LPS稀释至20μl后经腰椎穿刺鞘内注射。观察指标鞘内注射LPS后1h、3 h、6 h、12 h和24 h,测定热板反应潜伏期(Hot-plate Latency)。继鞘内注射LPS24h时测定热板潜伏期后,取腰段脊髓,分光光度法测定NO含量和NOS及其iNOS活性,RT-PCR测定IL-1βmRNA表达量。结果对痛行为学的影响鞘内注射LPS前,空白对照组、LPS组和氯胺酮组热板反应潜伏期相近。鞘内注射后,LPS组各时间点潜伏期数值显著低于氯胺酮治疗组(P<0.01)和空白对照组(P<0.05)。氯胺酮组各时间点热板潜伏期数值,除较空白对照组和LPS组显著为长(P<0.01)外,且与自身鞘内注射LPS前的热板潜伏期数值相比也明显延长。腰段脊髓NO含量、NOS和iNOS活性LPS组的N0、NOS和iNOS值显著高于空白对照组(P<0.01)和氯胺酮治疗组(P<0.01)。氯胺酮组NO和NOS值显著低于空白对照组(P<0.01),而iNOS与空白对照组并无显著性差异(P>0.05)。大鼠脊髓IL-1βmRNA表达量氯胺酮组(0.4377±0.0882),虽然高于空白对照组(0.2667±0.0732,P<0.01),但却显著低于LPS组(0.5744±0.0563,P<0.05)。结论鞘内注射LPS产生的中枢炎性病变能诱发大鼠热痛觉过敏,使腰段脊髓NOS和iNOS活性增强,NO合成增加,上调IL-βmRNA的表达。结果提示鞘内注射LPS诱发热痛觉过敏的机理可能与NO和促炎性细胞因子合成增加有关。氯胺酮可能通过阻滞NMDA受体,抑制胶质细胞的激活,降低IL-1βmRNA的表达,减少1L-1β的产生及其NO的生成,进而发挥其抗鞘内注射LPS所诱发的痛觉过敏。研究总结NMDA受体兴奋与痛觉过敏的产生密切相关。本研究用三种痛觉过敏动物模型,即鞘内吗啡耐受模型、L5脊神经切断模型、鞘内注射LPS诱发中枢炎症模型,探讨非竞争性NMDA受体拮抗剂氯胺酮抗痛觉过敏的效果及其机制。应用鞘内吗啡耐受模型,证实鞘内反复给予吗啡,导致吗啡抗伤害效应降低(吗啡耐受)和疼痛异常敏感(热痛觉过敏和痛觉超敏),鞘内吗啡耐受和痛觉过敏的机制可能与激活脊髓星形胶质细胞,增加促炎性细胞因子释放有关。鞘内给予氯胺酮,抑制脊髓星形胶质细胞激活,减少促炎性因子释放,从而防止吗啡耐受,减轻痛觉过敏。这些效应的机制可能与氯胺酮阻滞NMDA受体有关。通过L5脊神经切断神经病理疼痛模型,发现氯胺酮抑制L5脊神经切断诱发的痛觉过敏和机械性痛觉超敏,降低腰段脊髓IL-1β和IL-6的水平,可能与氯胺酮阻滞NMDA受体,抑制胶质细胞的激活有关。通过鞘内注射LPS诱发的中枢炎性疼痛模型,证明LPS鞘内注射同样诱发热痛觉过敏,氯胺酮显著抑制鞘内注射LPS所诱发的热痛觉过敏,其机制可能与其抑制脊髓NOS或者iNOS活性,减少NO的生成,抑制小胶质细胞和其它炎性细胞分泌的IL-1β和IL-6的释放有关。总之,脊髓胶质细胞的激活、NO的产生、促炎性细胞因子的合成释放增加,可能与多种痛觉过敏的发生与发展有关。非竞争性NMDA受体拮抗剂氯胺酮,通过阻滞NMDA受体,减少细胞内的Ca2+,抑制背角神经元及其介质对胶质细胞的激活,减少脊髓促炎性细胞因子的合成与释放,可能是氯胺酮抗痛敏作用的重要机理之一。研究结果为将氯胺酮合理用于诸如吗啡耐受、神经病理疼痛、中枢炎性病变所致痛觉过敏的预防和治疗提供了实验研究证据。

全文目录

中文摘要  4-11
英文摘要  11-20
正文  20-75
  引言  20-25
  第一部分氯胺酮与吗啡鞘内合用对吗啡耐受大鼠脊髓星形胶质细胞和促炎性细胞因子的影响  25-44
    前言  27-28
    材料和方法  28-31
    结果  31-34
    讨论  34-44
  第二部分氯胺酮对神经病理性疼痛大鼠脊髓促炎性细胞因子含量的影响  44-58
    前言  45-46
    材料与方法  46-48
    结果  48-51
    讨论  51-58
  第三部分氯胺酮对鞘内注射LPS大鼠痛觉过敏和脊髓NO/NOS、IL-1βmRNA的影响  58-75
    前言  59-60
    材料和方法  60-64
    结果  64-67
    讨论  67-75
综述  75-91
  胶质细胞源性促炎性细胞因子介导痛觉过敏及其意义  75-91
附录  91-92
  在校期间发表的论文  91-92
致谢  92

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