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一组导向融合蛋白的基因工程研究

作　者: 聂凌虎
导　师: 卢圣栋；李焕娄；李嗣英
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物药学
关键词: 融合蛋白导向药物毒素蛋白结构域氨基酸残基突变体免疫原性生物活性淋巴细胞大肠杆菌
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 1998年
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内容摘要

很多高免疫反应的疾病中都发现有白细胞介-2受体(IL-2R)阳性细胞的浸涧和聚集，如器官移植排斥、自身免疫性甲状腺病、Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎等。成人T淋巴细胞白血病细胞和爱滋病病毒HIV感染的细胞表面也含有丰富的IL-2受体。IL2受体阳性淋巴细胞在这些疾病的病理过程中起着关键性作用。因此可以通过IL-2与毒素蛋白的基因融合，表达出融合毒素用以对IL-2受体异常丰富的靶细胞进行特异杀伤，从而达到治疗疾病的目的。然而到目前为止，要将此类融合毒素导向药物推向实际临床应用却存在一个很大的障碍：大分子异源蛋白在体内的免疫原性问题。本论文分为四个部分。第一部分：融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因构建与诱导表达。第二部分：5种融合蛋白的快速纯化、生物活性测定及融合毒素抗血清的制备。第三部分：融合蛋白IL-2-K-PEZNM的纯化制备及药理活性的初步研究。前三部分的研究对象是IL-2与绿脓毒素的融合，主要目的是利用基因工程和蛋白质工程的方法，对本室曾经构建的融合毒素IL-2(60)-PE40进行一系列的基因突变与改造，探讨融合毒素结构与功能的关系，通过对突变体的活性比较，找到最适的构建突变融合基因的方式。第四部分：新型融合蛋白IL-2-TNFαM的纯化与初步药理实验。目的是探索一条构建无免疫原性融合毒素的新路在本文第一部分中，我们通过PCR反应、插入突变及缺失突变等方法，构建了5种融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因，绿脓毒素突变体PEZN是我们利用本实验室克隆到的PE40基因的特异性所得到的一种突变体形式以求创新，将经典的PE40删除其360-380位氨基酸而得到；突变体PEZNK是将PE40中360-380位氨基酸删除并以—段扩增于人IgG4基因的富含Lys编码的基因片段取代而得到；突变体PEZNM是在突变体PEZN的基础上删除其C末端最后一个Lys而得到。其中IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK的基因分别克隆于表达质粒pT7-7的T7启动子下游，与质粒pGP1-2共转化大肠杆菌K38，温控表达，表达水平分别为18.1％，18.5％；IL-2-PE38M，IL-2-PE38KM，IL-2-K-PE38M的基因分别克隆于本室所构建的高效表达质粒pLSD13的P_L启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，温控表达，表达水平分别为19.6％，19.8％，

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中文摘要  4-6
Abstract  6-9
文献综述(分子导向药物)  9-35
前言  35-39
第一部分融合基因IL2(60)-PEZN,IL-2(60)-PEZNK,IL-2-PEZNM,IL-2-PEZNKM,IL-2-K-PEZNM的构建与表达  39-83
第二部分 5种融合毒素快速制备、体外活性检测比较及兔抗融合毒素血清的制备  83-99
第三部分融合蛋白IL-2-K-PEZNM纯化与初步药理实验  99-114
第四部分融合蛋白IL-2-TNFαM的纯化与初步药理实验  114-125
结论  125-127
参考文献  127-133
致谢  133

一组导向融合蛋白的基因工程研究

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