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苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）pk-1基因结构及其激酶活性分析

作　者: 郭凯
导　师: 梁昌镛
学　校: 扬州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 杆状病毒 AcMNPV pk-1基因 截短型序列 亲和层析 激酶活性 大肠杆菌表达系统
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


激酶活性是pk-1基因重要的生物学活性。本研究旨在探讨AcMNPVpk-1基因及其不同截短型序列表达蛋白的激酶活性水平,从而得出该基因的哪些功能域对蛋白磷酸化是必需的;为进一步阐明杆状病毒pk-1基因在病毒感染复制中的功能以及调控自身极晚期基因转录表达的机制打下基础。研究中发现,利用原核表达系统表达的外源pk-1基因及其截短型序列具有一定的激酶活性。通过比较,并结合Prosite数据库分析,推测出:PK-1蛋白具有一定的激酶活性,该蛋白的51-183区域可能是其功能域,该区域对pk-1基因的激酶活性是必需的。同时,pk-1基因及其不同截短型序列表达蛋白自身激酶活性不具有检测价值。论文共包括四章:第一章对杆状病毒做了综述性介绍,包括杆状病毒的分类、形态结构、侵染与复制,重点介绍了杆状病毒相关的蛋白激酶及其研究现状,同时还介绍了杆状病毒的应用及本研究的目的等。第二章克隆出了pk-1基因及其不同截短型序列,并将其连接到表达载体pMAL-c2x上;同时,对pk-1基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得到相关的关键区域,为后续确定该基因功能域提供参考。第三章实现了pk-1基因及其不同截短型序列的表达、纯化和激酶活性测定,并预测了pk-1基因的必需功能域。第四章总结和讨论了本课题研究的结果,并对以后的研究做了展望。

全文目录


中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
第一章 文献综述  9-22
  1 杆状病毒的研究背景  9-14
    1.1 杆状病毒的分类和生活形态  9-10
    1.2 杆状病毒基因  10-11
      1.2.1 功能基因分类  10-11
      1.2.2 结构蛋白基因  11
    1.3 杆状病毒的复制与感染  11-13
    1.4 杆状病毒的应用  13-14
  2 蛋白激酶（PK）  14-16
    2.1 病毒粒子相关的蛋白激酶  14-15
    2.2 VAPK 研究现状  15
    2.3 杆状病毒中的蛋白激酶（PK）  15-16
  3 层析技术及其应用  16-21
    3.1 原核基因表达产物的分离方法  16-19
      3.1.1 蛋白质在原核细胞中的表达形式  16
      3.1.2 原核蛋白的分离与提纯  16-18
      3.1.3 分离纯化标签简介  18-19
    3.2 层析技术在分离纯化中的应用  19-20
    3.3 亲和层析及其原理  20-21
  4 本项目研究的目的和意义  21-22
第二章 AcMNPV 的pk-1 基因及其不同截短型序列的克隆  22-34
  1 背景  22
  2 材料  22-25
    2.1 大肠杆菌菌株  22
    2.2 病毒和 Bacmid  22
    2.3 质粒和载体  22-23
    2.4 引物  23-24
    2.5 工具酶和相关试剂  24
    2.6 供试试剂盒  24
    2.7 电泳缓冲液  24
    2.8 培养基和抗生素  24-25
  3 方法  25-29
    3.1 大肠杆菌中AcBacmid 的提取  25
    3.2 PCR 反应体系和程序  25-26
    3.3 大肠杆菌中质粒的提取方法  26-27
    3.4 DNA 限制性酶切和 PCR 产物的回收  27-28
    3.5 连接反应  28
    3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  28-29
  4 结果与分析  29-34
    4.1 pk-1 基因及其不同截短型序列的扩增  29-30
    4.2 重组克隆质粒的双酶切鉴定  30-31
    4.3 pMAL-c2x/Z-Z5重组表达质粒的双酶切鉴定  31
    4.4 pk-1 及其不同截短型序列分析  31-34
第三章 AcMNPV 的pk-1 基因及其不同截短型序列的表达、纯化和磷酸化活性分析  34-44
  1 背景  34
  2 材料  34-36
    2.1 表达菌株  34
    2.2 培养基和缓冲液  34-35
    2.3 相关试剂和试验用品  35
    2.4 SDS-PAGE 电泳所需试剂  35
    2.5 SDS-PAGE 电泳凝胶的灌制  35-36
  3 方法  36-38
    3.1 Rosetta感受态细胞的制备  36
    3.2 重组表达质粒的转化  36
    3.3 MBP 融合蛋白的表达  36-37
    3.4 MBP 融合蛋白大规模表达  37
    3.5 亲和层析法纯化MBP 融合蛋白  37-38
    3.6 重组蛋白磷酸化活性测定  38
  4 结果与分析  38-44
    4.1 pk-1基因及其不同截短型序列蛋白表达、纯化  38-40
      4.1.1 pk-1 基因及其对照组蛋白的表达与纯化  38-39
      4.1.2 不同截短型序列蛋白的表达与纯化  39-40
    4.2 pk-1 基因及其不同截短型序列表达蛋白磷酸化活性测定  40-42
    4.3 重组表达蛋白及其磷酸化活性分析  42-44
第四章 总结与讨论  44-47
  1 总结  44
  2 讨论  44-47
参考文献  47-52
致谢  52

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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