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对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry基因分离克隆和工程菌的构建

作　者: 张杰
导　师: 黄大昉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: Bt22 UV17 cry3Aa cry1Ba 基因克隆穿梭载体工程菌鞘翅目害虫
分类号: S433.5
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

鞘翅目害虫是农业、林业上重要害虫。从Bt菌中分离克隆杀鞘翅目害虫的特异基因，将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源，缩小国内外在Bt杀虫基因基础研究领域中的差距，为工程菌和抗虫转基因植物的研制提供新的基因来源。本论文在系统研究对鞘翅目叶甲科害虫高毒力Bt菌株Bt22和对鞘翅目、鳞翅目高毒力的UV17菌株的生物学特性的基础上，开展了cry3Aα、cry1Bα基因分离克隆、表达载体构建和高效双价杀虫工程菌的构建及其杀虫活性测定等项研究，结果如下：1、系统地研究了国内Bt分离菌株Bt22和UV17的生物学特性。UV17生长6小时进入对数生长期，生长速率略快于Bt22（8小时），Bt22与已知标准菌株Btt生长速率相当。Bt22形成2～5μm扁平方形晶体，体积较Btt大（1～2μm）。UV17形成2μm双锥体形晶体，体积比HD-73等菌株晶体大。这两种晶体蛋白分子量分别为73.1kDa和140kDa。PCR-RFLP基因鉴定结果表明Bt22和UV17分别含有单一的cry3Aα、cry1Bα基因。Bt22含有4种质粒，cry3Aα基因定位于40kb的质粒上。UV17含有8种质粒，cry1Bα基因定位于20kb的质粒上。生化反应和酯酶图谱分析结果表明Bt22同Bt拟步行甲亚种（Bacillus thuringiensis subsp.tenebroinis）和莫里逊亚种（B.t.subsp morrisoni）一致。UV17酯酶谱带与Bt苏云金亚种（B.t.Subsp.thuringiensis）相同。2、利用cry3Aα基因PCR扩增产物作为探针对Bt22质粒酶切产物进行杂交，结果表明Bt22只含有1个拷贝的cry3Aα基因，该基因定位于质粒中国农业科学院博士学位论文DNA 3kb的 Hindlll酶切片段上。根据杂交结果分离克隆了cry3Aa全长基因，完成了亚克隆和 DNA序列测定。该基因编码区全长为 1932 bPS，编码 644个氨基酸的晶体蛋白，分于量 73．IkDa，等电点为 pHiz．165，属于弱酸性蛋白。该基因序列己在EMBL、GenBank中登记注册，AccessionNumber为 AJ23 7900，提交国际 Bt－6－内毒素基因命名委员会后，被正式命名为cly3Aa7。这是目前国内分离克隆的第一个对鞘翅目害虫高毒力的Cry基因。 Southern杂交结果表明cryjBa基因作为单一拷贝定位于质粒DNABarnHI、Sacl、Sail约 10kb的酶切片段上。本研究设计了一对特异性引物，以UV17质粒为模板扩增了cry1BQ 5－端2058bps片段，将此片段克隆于pGEM1 Easy载体后，进行序列测定，结果表明在该片段的第 1055位碱基与已知的cry1Bal基因存在差异，由A变成G，其编码的氨基酸也由组氨酸（HIS）变成精氨酸（AIg），说明UV17中的Cy1Ba是一种新的基因。通过计算机分析cry1Bal 2058bps大片段所编码的686个氨基酸组成的多肽，等电点为出．665，而UV17中CIy1Ba基因所编码的686个氨基酸组成的多肋等电点为叫．705，HIS和AIg均为碱性氨基酸，它们之间的替换对整个多肽的酸碱性、等电点影响很小。采用部分酶切方法建立了UV质粒文库，通过PCR鉴定、筛选，己获得两个含有Cy1Ba基因的大片段阳性克隆，外源片段分别为 10kb和 9．skb，亚克隆和序列测定研究正在进行。3、为便于 Bt Cry基因快速分离克隆、遗传转化和表达研究，本研究将来自假单胞菌的复制区 1．Zkb DNA片段插入穿梭载体 pHT315ptECO灼的Aatll位点，成功构建了一种能在苏云金杆菌·大肠杆菌．荧光假单胞菌（BtECOli－Pfj三种宿主之间穿梭，并能稳定遗传的广宿主载体 pGMll05 2 DS 门．7kbh 该载体携带氨书青霉素（AmP）和红霉素爬r）抗性基因，保留了 pUC多克隆位点，能在三种细菌中正常复制，稳定遗传，在荧光假单胞菌和 Bt菌株中 48小时稳定性超过90％。将 cry3Aa7全长基因分别克隆于 pHT315和 pGMll05多克隆位点上，获得表达载体pHY512（Bt－ECOli穿梭郴 pLF3ll05（Bt－ECOli－刀穿梭）。将 pHY512、pLF3 05分别电击转化 Bt无晶体突变株 BE20和 Bt自然菌株 UV 17中，构建了两种工程菌Biotlll205和Biotllll 75。研究表明带有cry3Aa7 基因的表达载体能在 BE20和 UV菌株中稳定遗传，稳定性达 90o以上。 cry3Aa7在UV17菌株中能正常、稳定表达，蛋白质表达量与其在Bt22中没有明显差异，表达时间与Bt22 同步，生长曲线变化不大，由此说明外源基因的导入对 UV生长发育没有不良影响，从而说明自然菌株 UV 17 是一种研究基因表达调控和构建工程菌的优良受体菌。培养基营养组分的变化对工程菌中双价基因共表达有显著的影响，选择 1／2 LB培养基培养 Bt工程菌 Biotllll75，能保证 cry！Ba和 cry3Aa基因在同一受体菌内均能正常表达，互不干扰；而在GT、Z氏培养基中虽然cry3Aa7表达正常，但是cry！Ba表达量极低。cry3Aa

全文目录

中文摘要  5-9
前言  9
Bt杀虫蛋白及其基因研究  9-23
马铃薯甲虫—全球最重要的鞘翅目害虫  23-24
对鞘翅目有活性的Bt cry基因研究进展  24-26
立题依据和目的意义  26-28
第一章 Bt菌株Bt22和UV17生物学特性研究  28-37
  1．1 材料与方法  28-30
  1．2 结果与分析  30-36
  1．3 讨论  36
  1．4 小结  36-37
第二章 cry3Aα基因的分离克隆  37-49
  2．1 材料与方法  37-39
  2．2 结果与分析  39-47
  2．3 讨论  47-48
  2．4 小结  48-49
第三章 cry1Bα基因的分离克隆  49-61
  3．1 材料与方法  49-51
  3．2 结果与分析  51-59
  3．3 讨论  59-60
  3．4 小结  60-61
第四章工程菌的构建  61-74
  4．1 材料与方法  61-64
  4．2 结果与分析  64-72
  4．3 讨论  72
  4．4 小结  72-74
第五章工程菌杀虫活性研究  74-85
  5．1 材料与方法  74-75
  5．2 结果与分析  75-82
  5．3 讨论  82-84
  5．4 小结  84-85
第六章结论  85-88
参考文献  88-105
英文摘要  105-109
致谢  109

对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry基因分离克隆和工程菌的构建

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