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巴斯德杆菌科细菌复制温敏型质粒的构建及初步应用

作　者: 赵静静
导　师: 周锐
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 巴斯德杆菌科多杀性巴氏杆菌胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体复制温敏型质粒
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

巴斯德杆菌科(Pasteurellaceae)主要包括巴氏杆菌属(Pasteurella),放线杆菌属(Actinobacillus)和嗜血杆菌属(Haemophilus)。此菌科包含大量使动物致病的病原体,它们可以使很多家畜致病甚至死亡,给养殖业带来了巨大的经济损失,全世界对此菌科的病原菌的关注度日益增高。为了研究致病菌的致病机理,对其基因的功能进行研究是必须的。基因功能研究的常规方法是构建基因突变菌株。目前使用的基因突变方法,如自然转化,接合转移以及自杀质粒电转化的转化效率和发生同源重组双交换的效率比较低下,所以一套高效的突变系统的建立是非常必要的。由于复制温敏型质粒在特定温度下能够自动丢失,能够快速鉴定发生同源重组双交换的突变体,并且在PCR定向突变系统中能够充当表达载体和介导双交换的克隆载体,在重组酶的辅助下,双交换的概率会大大提高,因此复制温敏型质粒能够很大程度上提高突变系统的效率。本研究对巴斯德杆菌科细菌来源的质粒pD70KanR进行了序列测定和分析,发现此质粒具有一个卡那霉素抗性基因,一个链霉素抗性基因和一个磺胺抗性基因,还含有一个在结合转移中必不可少的mobA基因,并用DNAMAN软件分析了此质粒的酶切位点,得到了一些单一酶切位点,可用于克隆。随后,验证了pD70KanR在APP和Pm中都是穿梭质粒,通过PCR定点突变,构建了在Pm和APP中的复制温敏型质粒pGA318和pSK-GA318,并分析了这两个质粒在Pm和APP中不同传代时间和培养温度下的复制特性,即在30℃可以正常复制,经过传代,在高于41℃的情况下丢失。pGA318和pSK-GA318在Pm中,42℃传3代即可丢失；pGA318和pSK-GA318在APP中,42℃要传9代才能丢失。这些结果为构建Pm和APP等巴斯德杆菌科细菌的高效突变系统打下了基础。最后,将复制温敏型载体pGA318应用于APP脲酶C基因缺失的筛选,即将脲酶C基因的上下游同源臂克隆到pGA318中,然后利用同源重组的原理尝试缺失APP的脲酶C基因,但未能得到突变体,可能是因为pGA318中卡那抗性表达盒在APP中高温环境下不表达,不利于筛选突变体。此外,还验证了来自波氏杆菌的质粒pJN105和pD70kanR在APP中能够共同存在,为以后能在APP中同时表达两种不同的蛋白提供了基因操作工具。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表(Abbreviation)  9-10
1 文献综述  10-18
  1.1 巴斯德杆菌科细菌的概述  10-14
    1.1.1 多杀性巴氏杆菌(Pm)  10-11
    1.1.2 胸膜肺炎放线杆菌(APP)  11-13
    1.1.3 副猪嗜血杆菌(HPS)  13-14
  1.2 巴氏杆菌突变菌株的构建方法  14-17
    1.2.1 自然突变法  14
    1.2.2 化学诱变法  14-15
    1.2.3 同源重组法  15-17
  1.3 巴斯德杆菌科细菌的转化方法  17-18
    1.3.1 自然转化法  17
    1.3.2 电转化法  17-18
2 研究目的与意义  18-19
3 材料与方法  19-27
  3.1 实验材料  19-22
    3.1.1 菌株、质粒和培养条件  19-20
    3.1.2 寡核苷酸引物  20-21
    3.1.3 主要试剂,试剂盒及仪器  21
    3.1.4 培养基和抗生素的配制  21
    3.1.5 其他相关试剂  21-22
  3.2 实验方法  22-27
    3.2.1 PCR的扩增  22
    3.2.2 DNA片段的回收及纯化  22-23
    3.2.3 DNA片段的连接  23
    3.2.4 质粒或连接产物的转化  23-24
    3.2.5 质粒的小提  24-25
    3.2.6 质粒的大提  25
    3.2.7 转化子的筛选与鉴定  25-26
    3.2.8 一步法质粒PCR定点突变  26-27
4 结果与分析  27-41
  4.1 pD70kan~R在Pm和APP中的复制特征  27-28
    4.1.1 pD70kan~R在E.coil和Pm、E.coil和APP中的穿梭性  27
    4.1.2 pD70kan~R和pJN105在APP中的共转化  27-28
  4.2 pD70kan~R的序列分析  28-29
  4.3 复制温敏型质粒的构建  29-32
  4.4 pSA720Cm~R,pGA318和pSK-GA318对APP和Pm的电转化效率  32
  4.5 pGA318和pSK-GA318在Pm和APP中的复制特性  32-41
    4.5.1 pGA318和pSK-GA318在Pm中的复制特性  32-37
    4.5.2 pGA318和pSK-GA318在APP中的复制特性  37-38
    4.5.3 pGA318在APP中的应用  38-41
5 讨论  41-45
  5.1 pD70kan~R在巴斯德杆菌科细菌中的广谱性  41
  5.2 pD70kan~R和pJN105在APP中的共容性  41
  5.3 突变质粒的构建  41-42
  5.4 pGA318和pSK-GA318在巴斯德杆菌科细菌的温敏特性  42-43
  5.5 pGA318和pSK-GA318在巴斯德杆菌科细菌中构建PCR定向突变系统的应用  43-45
6 结论与展望  45-46
参考文献  46-50
致谢  50

巴斯德杆菌科细菌复制温敏型质粒的构建及初步应用

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