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紫菜遗传多样性分析及其6-磷酸海藻糖合成酶基因转化水稻的研究

作　者: 乔利仙
导　师: 戴继勋；王斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 紫菜 多样性 6-磷酸海藻糖合成酶 水稻 抗逆性
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 228次
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内容摘要


用分子标记技术进行紫菜遗传多样性分析对于紫菜种质资源的鉴定、保护和持续合理开发利用具有重要意义。本研究采用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP);靶位区域扩增多态性(target region amplification polymorphism,TRAP);限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism,RSAP)三种分子标记技术对16个紫菜系进行了遗传多样性分析,在此基础上对生产上广泛应用的条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phosphate synthase from Porphyra yezoensis,PyTPS )进行了转化水稻的研究。本研究首次将分子标记技术SRAP、TRAP和RSAP用于紫菜的种质资源分析。建立了适合于紫菜SRAP、TRAP和RSAP分析的PCR反应体系和反应条件,利用所建立的体系对16个紫菜系进行了遗传多样性分析,构建了这些紫菜系的聚类图和DNA指纹图。三种分子标记方法聚类分析所产生的进化树基本一致,均把这些紫菜系分成两大类,分类结果与传统分类相吻合。在所构建的DNA指纹图谱中,每个紫菜系都有其特异的指纹模式,能很容易地与其它紫菜系区分开来。根据DNA指纹图谱开发出计算机应用软件PGI-SRAP,PGI-TRAP,PGI-RSAP(Porphyra germplasm identification developed by SRAP,TRAP and RSAP method),可以辅助进行紫菜系的种质鉴定。对RSAP分析产生的17条特异性标记中的6条进行了克隆、测序,并将其中一个标记R1/R3-8119转换成紫菜系P. yezoensis Y-9101的特异序列扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)标记。用本实验室克隆的条斑紫菜TPS基因(PyTPS)转化水稻品种TP309,得到的T0代转基因植株,经过连续加代、鉴定、筛选,得到5个T2代的纯合体株系,对其中3个株系(TPS155-4,TPS191-1和TPS308-1)进行了PCR和Southern杂交检测,结果都呈双重阳性,表明PyTPS基因已整合到这些转基因株系中。用0.8%NaCl模拟盐碱条件,16% PEG-6000模拟干旱条件,以非转基因水稻TP309为对照,选T2代两个纯合体株系TPS155-4和TPS191-1进行了抗盐、抗旱性分析。RT-PCR结果表明转入的基因得以表达,转基因株系的株高、单株鲜重均高于对照,在PEG处理下这种差异达到显著水平。这说明PyTPS基因的导入,明显增加了转基因水稻的抗旱性;转基因水稻的抗盐性也有所提高。

全文目录


中文摘要  2-4
英文摘要  4-6
缩写词表  6-13
第一章 文献综述  13-39
  1 紫菜研究概况  14-15
  2 分子标记发展概况  15-21
    2.1 基于DNA杂交技术的分子标记  16-17
      2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)  16
      2.1.2 DNA可变串联重复数标记(variable number of tandem repeats, VNTR)  16-17
    2.2 基于PCR技术的分子标记  17-21
      2.2.1 随机扩增多态性 DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)  17
      2.2.2 酶切位点扩增多态性 (cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS)  17
      2.2.3 扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphisms, AFLP)  17-18
      2.2.4 简单重复序列 (simple sequence repeats, SSR)  18
      2.2.5 简单序列重复区间扩增多态性 (inter-simple sequence repeats, ISSR)  18-19
      2.2.6 序列特异扩增区域 (sequence characterized amplified region, SCAR)  19
      2.2.7 DNA单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)  19
      2.2.8 相关序列扩增多态性 (sequence-ralated amplified polymorphism, SRAP)  19-20
      2.2.9 靶位区域扩增多态性 (target region amplified polymorphism, TRAP)  20-21
    2.3 基于DNA序列信息的分子标记  21
  3 分子标记的应用  21-27
    3.1 构建分子连锁图谱  21-22
    3.2 基因的分子标记与定位  22-23
    3.3 品种的纯度鉴定  23
    3.4 分子标记的辅助选择  23-24
    3.5 杂种优势预测  24
    3.6 遗传多样性研究  24
    3.7 分子标记在紫菜分类学及种质鉴定中的应用  24-27
      3.7.1 RAPD 分析在紫菜属中的应用  25
      3.7.2 AFLP分析在紫菜属中的应用  25-26
      3.7.3 SSR分析在紫菜属中的应用  26
      3.7.4 ISSR分析在紫菜属中的应用  26-27
      3.7.5 分子标记在紫菜属中应用的前景展望  27
  4 海藻糖研究概况  27-39
    4.1 海藻糖的代谢途径及其相关基因  28-31
      4.1.1 海藻糖生物合成途径及其相关基因  28-30
        4.1.1.1 OtsA、OtsB途径  28-29
        4.1.1.2 TreY、TreZ途径  29
        4.1.1.3 TreS途径  29-30
        4.1.1.4 其它途径  30
      4.1.2 海藻糖生物分解途径及其相关基因  30-31
    4.2 海藻糖的生物学功能  31-33
    4.3 海藻糖合成酶基因的研究  33-36
    4.4 海藻糖合成酶基因对植物的遗传转化  36-39
第二章 利用分子标记技术研究紫菜遗传多样性  39-76
  第一节 紫菜SRAP 分析及指纹图谱的建立  40-52
    1 材料  40-42
    2 方法  42-44
      2.1 DNA 提取及纯化  42
      2.2 SRAP 分析  42-44
      2.3 数据统计和聚类分析  44
      2.4 SRAP-DNA 指纹图谱的构建和计算机化  44
    3 结果与分析  44-49
      3.1 SRAP 分析  44-46
      3.2 数据统计和聚类分析  46-47
      3.3 SRAP-DNA 指纹图谱的构建  47-48
      3.4 SRAP-DNA 指纹的计算机化  48-49
    4 讨论  49-52
  第二节 紫菜TRAP 分析及指纹图谱的建立  52-64
    1 材料  52-54
    2 方法  54-56
      2.1 DNA 提取及纯化  54
      2.2 引物设计  54-56
      2.3 TRAP 分析  56
      2.4 数据统计和聚类分析  56
      2.5 DNA 指纹图谱的构建和计算机化  56
    3 结果与分析  56-61
      3.1 TRAP 分析  56-58
      3.2 数据统计和聚类分析  58-59
      3.3 DNA 指纹的构建和计算机化  59-61
    4 讨论  61-64
  第三节 RSAP 分析在紫菜种质鉴定中的应用  64-76
    1 材料  64
    2 方法  64-67
      2.1 DNA 提取及纯化  64-65
      2.2 引物设计  65
      2.3 RSAP 分析  65-66
      2.4 数据统计和聚类分析  66
      2.5 DNA 指纹图谱的构建和计算机化  66
      2.6 SCAR 标记的转换  66-67
    3 结果与分析  67-74
      3.1 RSAP 分析  67-69
      3.2 数据统计和聚类分析  69
      3.3 DNA 指纹图谱的构建和计算机化  69-71
      3.4 SCAR 标记的转换  71-74
    4 讨论  74-76
第三章 条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因在水稻中的表达分析  76-96
  第一节 条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因转化水稻的研究  77-87
    1 材料  77
      1.1 表达载体  77
      1.2 供试菌株  77
      1.3 供试水稻品种  77
      1.4 试剂和培养基  77
    2 方法  77-82
      2.1 农杆菌介导的PyTPS 基因的水稻转化  77-80
        2.1.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养  77-78
        2.1.2 农杆菌的培养  78
        2.1.3 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养  78-79
        2.1.4 抗性愈伤组织的筛选  79
        2.1.5 抗性愈伤组织的分化  79
        2.1.6 生根，壮苗和移栽  79-80
      2.2 转基因水稻植株的检测  80-82
        2.2.1 转基因植株的PCR 检测  80-81
        2.2.2 转基因植株的卡那霉素抗性检测  81
        2.2.3 转基因植株的Southern 检测  81-82
    3 结果与分析  82-85
      3.1 转基因水稻植株的获得及加代繁殖  82-83
      3.2 转基因植株的PCR 检测  83-84
      3.3 转基因 T_2 代植株的卡那霉素抗性筛选  84-85
      3.4 转基因 T_2 代植株的 Southern 杂交检测  85
    4 讨论  85-87
  第二节 条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因对提高水稻抗逆性的研究  87-96
    1 材料  87
    2 方法  87-89
      2.1 转基因水稻植株的盐胁迫、旱胁迫处理  87
      2.2 表型性状的鉴定  87
      2.3 电导率的测定  87-88
      2.4 RT-PCR 分析  88-89
    3 结果与分析  89-94
      3.1 转基因水稻植株的盐胁迫、旱胁迫反应  89
      3.2 盐胁迫和旱胁迫对株高的影响  89-91
      3.3 盐胁迫和旱胁迫对单株生物量的影响  91-92
      3.4 盐胁迫和旱胁迫对细胞膜渗透的影响  92-93
      3.5 转基因植株PyTPS 的表达分析  93-94
    4 讨论  94-96
结论  96-97
参考文献  97-108
附录  108-110
在读期间完成的文章  110-111
致谢  111

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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