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子宫内膜异位症血管生成及靶向基因治疗的研究

作　者: 孙俊杰
导　师: 糜若然；尹利荣
学　校: 天津医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 血管内皮抑素基因 腺相关病毒 动物模型 裸鼠 子宫内膜异位症 抗血管生成 基因治疗 周细胞
分类号: R711.71
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


第一部分携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒的制备和鉴定目的构建携带人血管内皮抑素(Endostatin)基因的腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP,进而包装携带人血管内皮抑素基因的2型重组腺相关病毒(rAAV2-Endostatin-EGFP),为下一步探讨其在抗血管生成基因治疗动物模型实验中的作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,从pCD-sEndostatin质粒获得Endostatin cDNA,并将PCR扩增产物插入至AAV包装质粒pSNAV-CMV-EGFP上,构建pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP的AAV重组包装质粒,经PCR、酶切及测序鉴定。用Lipofectamine 2000将此包装质粒转染BHK-21细胞,建立载体细胞株。在转瓶中培养,用HSV1-rc/ΔUL2感染后收集培养物,进行纯化并测定其滴度。用rAAV2-Endostatin-EGFP感染BHK-21细胞24、48小时后(MOI=1×105v.g./cell)在荧光显微镜观察目的基因Endostatin在细胞表面的表达,即转染效率；48小时后采用BCA法检测目的基因Endostatin在蛋白水平的表达。结果经PCR、酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP构建成功,进而rAAV2-Endostatin-EGFP包装成功。所包装纯化的重组病毒滴度达5×1011v.g./ml。利用PCR反应进行鉴定,扩增得到Endostatin。rAAV2-Endostatin-EGFP能有效感染BHK-21细胞,24小时后,转染效率为50%；48小时后为70%,并检测培养液上清液中血管内皮抑素蛋白浓度达194μg/ml。结论构建的AAV包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP可作为rAAV2-Endostatin-EGFP表达载体的包装质粒。成功包装的rAAV2-Endostatin-EGFP病毒,可直接用于抗血管生成基因治疗的实验研究。第二部分子宫内膜异位症裸鼠模型的建立目的建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,观察异位种植病灶新生血管生成并探讨周细胞在血管生成过程中作用。方法通过开腹手术方法将人子宫内膜组织块种植于裸鼠盆腹腔,1周后观察其生长情况,并进行病理检查,同时采用免疫组化S-P法检测异位病灶内微血管密度(MVD, CD34标记)和周细胞(平滑肌肌动蛋白,a-SMA标记)的情况。结果成功建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,异位种植病灶能保持原有内膜组织的形态结构,并可见血管生成明显。内皮细胞CD34表达阳性,周细胞a-SMA表达阳性。高血管密度区的MVD为(16.20±1.64)条,阳性周细胞数为(22.40±7.23)个,低血管密度区MVD为(3.62±1.50)条,阳性周细胞数为(15.56±5.34)个,高血管密度区MVD及周细胞数均高于低血管密度区,差异具有统计学意义(P<0.05)。高血管密度区周细胞与MVD的比值为(1.38±0.13),低血管密度区则高达(4.30±0.92),两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论子宫内膜异位症裸鼠模型的建立是子宫内膜异位症早期临床研究的理想模型,而且异位种植病灶组织内血管新生的早期即有周细胞存在。周细胞可能参与异位种植病灶组织血管生成过程,周细胞在血管生成中可能起负向调节作用。第三部分重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因治疗裸鼠子宫内膜异位症目的研究重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因对裸鼠子宫内膜异位症的治疗作用。方法建立子宫内膜异位症裸鼠模型1周后,取建模成功的60只裸鼠作为实验研究对象,分为三组：治疗组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-Endostatin-EGFP;空载体对照组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-EGFP;空白对照组20只,于异位病灶局部直接注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。分别于给药后1、2、3周各开腹一次,观察裸鼠盆腹腔病灶,同时留取异位病灶组织,观察各组裸鼠异位病灶中人血管内皮抑素蛋白表达情况和检测腺体数目；采用免疫组化S-P法检测病灶中微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况；同时称量体重观察脂肪沉积情况。于给药后3周猝死,采用ELISA法检测各组裸鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的水平；并对各组裸鼠卵巢、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行病理学检查。结果(1)荧光显微镜下观察,给药后1、2、3周,治疗组裸鼠异位病灶组织腺体和间质内出现绿色荧光；而空载体对照组和空白对照组裸鼠异位病灶组织内未见绿色荧光。rAAV2-Endostatin-EGFP局部注射异位病灶后在异位病灶腺体和间质可见人血管内皮抑素蛋白表达。(2)给药1周后,治疗组裸鼠异位病灶平坦、中央下陷,光镜下可见腺体数减少,腺腔变窄,细胞稀疏、呈萎缩状态。(3)各组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数,治疗组分别为(7.8±1.9)、(7.0±1.5)和(5.5±1.73)个,均低于空载体对照组[分别为(10.1±1.7)、(10.2±2.0)和(9.84±2.4)个]和空白对照组[分别为(10.2±2.2)、(10.0±2.0)和(9.7±2.2)个],差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(4)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内的MVD,治疗组分别为(12.2±1.5)、(11.44±2.1)、(9.0±1.4)条,均低于空载体对照组[分别为(16.5±1.7)、(16.5±1.9)、(16.9±1.9)条]和空白对照组[分别为(16.2±1.6)、(16.0±1.6)、(16.3±1.7)条],差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内MVD比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(5)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF的阳性率及表达强度,治疗组分别为35%、30%、25%和1.60±0.43、1.33±0.30、1.03±0.36,均低于空载体对照组[分别为80%、75%、85%和2.43±0.53、2.43±0.29、2.66±0.45]和空白对照组[分别为85%、90%、90%和2.36±0.53、2.64±0.57、2.53±0.52],差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF阳性率及表达强度比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(6)治疗组裸鼠体重[17.79±1.28、17.63±1.21和17.64±1.26 g]在给药后1、2、3周分别与空载体对照组[17.87±1.43、17.66±1.63和17.74±1.53 g]和空白对照组[17.62±1.57、17.54±1.54和17.55±1.59 g]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。而且各组治疗前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(7)给药后3周,治疗组裸鼠血清中的雌二醇、孕酮水平分别为(48±7) pmol/L、(61±8)nmol/L,与空载体对照组[分别为(50±9) pmol/L、(60±10) nmol/L]、空白对照组[分别为(48±7) pmol/L、(58±10) nmol/L]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(8)给药后3周,对治疗组裸鼠的卵巢、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行显微镜下观察,未发现缺血、坏死和炎症改变。结论携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒可抑制裸鼠子宫内膜异位症病灶的血管生成,从而抑制异位病灶的生长,而不影响体内性激素水平和脂肪沉积,对卵巢、子宫和其他重要脏器也无影响,抗血管生成基因治疗可能成为子宫内膜异位症治疗的新选择。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-13
符号说明  13-15
前言  15-20
  研究现状、成果  15-18
  研究目的、方法  18-20
一、携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒的制备和鉴定  20-62
  1.1 材料和方法  20-35
    1.1.1 试剂与仪器  20-25
    1.1.2 实验方法  25-35
  1.2 结果  35-50
    1.2.1 原始质粒pCD-sEndostatin的鉴定结果  35-42
    1.2.2 重组质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP成功构建及鉴定结果  42-47
    1.2.3 rAAV2-Endostatin-EGFP包装成功  47-50
  1.3 讨论  50-61
    1.3.1 重组腺相关病毒(rAAV)的结构特点  52-55
    1.3.2 rAAV2包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP的结构特点  55-57
    1.3.3 rAAV2-Endostatin-EGFP的大规模制备  57-59
    1.3.4 rAAV2-Endostatin-EGFP进入细胞感染过程和外源基因的表达  59-61
  1.4 小结  61-62
二、子宫内膜异位症裸鼠模型的建立  62-77
  2.1 材料和方法  62-68
    2.1.1 材料来源  62-65
    2.1.2 实验方法  65-68
    2.1.3 统计学方法  68
  2.2 结果  68-70
    2.2.1 种植成功率  68
    2.2.2 大体观察  68
    2.2.3 光镜观察  68-69
    2.2.4 异位病灶内微血管密度和周细胞免疫组织化学染色及形态计量  69-70
  2.3 讨论  70-76
    2.3.1 裸鼠的特性  70-71
    2.3.2 子宫内膜异位症裸鼠模型建立  71-73
    2.3.3 子宫内膜异位症裸鼠模型的移植异位病灶血管形成特点  73-75
    2.3.4 子宫内膜异位症裸鼠模型在抗血管生成治疗中的应用  75-76
  2.4 小结  76-77
三、重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因治疗裸鼠子宫内膜异位症  77-99
  3.1 材料和方法  77-81
    3.1.1 材料来源  77-79
    3.1.2 实验方法  79-81
    3.1.3 统计学方法  81
  3.2 结果  81-91
    3.2.1 rAAV2-Endostatin-EGFP对异位病灶的作用  81-82
    3.2.2 异位病灶中人血管内皮抑素蛋白原位表达  82-83
    3.2.3 rAAV2-Endostatin-EGFP对异位病灶内腺体数目的影响  83-84
    3.2.4 rAAV2-Endostatin-EGFP对异位病灶内微血管密度的影响  84-85
    3.2.5 rAAV2-Endostatin-EGFP对异位病灶内VEGF表达的影响  85-87
    3.2.6 rAAV2-Endostatin-EGFP对裸鼠体重的影响  87-88
    3.2.7 rAAV2-Endostatin-EGFP对血清性激素水平的影响和对子宫、卵巢影响  88-89
    3.2.8 rAAV2-Endostatin-EGFP对全身重要脏器的影响  89-91
  3.3 讨论  91-98
    3.3.1 血管内皮抑素的结构及抗血管生成作用  91-93
    3.3.2 重组腺相关病毒介导的血管内皮抑素基因在体内表达的意义  93-94
    3.3.3 携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒对裸鼠子宫内膜异位症局部治疗作用  94-95
    3.3.4 携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒对裸鼠异位病灶内VEGF的影响  95-98
  3.4 小结  98-99
全文结论  99-100
论文创新点  100-101
参考文献  101-109
发表论文和参加科研情况说明  109-110
综述  110-119
  子宫内膜异位症裸鼠模型的建立与血管生成研究进展  110-116
  综述参考文献  116-119
致谢  119-120

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 妇科学 > 女性生殖器其他疾病 > 子宫内膜异位症
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