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筛选应用于β-地中海贫血基因治疗中的高效转导杂合型AAV载体
作 者: 刘珍清
导 师: 谭孟群
学 校: 中南大学
专 业: 生理学
关键词: 造血干/祖细胞 间充质干细胞 腺相关病毒 β-地中海贫血 基因治疗
分类号: R556.61
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
目的:本研究优化构建包装纯化携带标记基因GFP的重组杂合型AAV载体,用各重组杂合型AAV载体感染来源于人的造血干/祖细胞,筛选高效转导人的造血干/祖细胞的杂合型AAV载体,以此构建携带β-珠蛋白基因的杂合型AAV载体,转导流产的β-重型地贫胎儿骨髓源造血干/祖细胞,将转染后的细胞移植入照射裸鼠体内,系统检测受体鼠内人β-珠蛋白基因的表达水平,筛选出高效转导的杂合型AAV载体。方法与结果:1.造血干/祖细胞和间充质干细胞的分离培养本研究采用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法获取人造血干/祖细胞,流式检测分离纯度,集落培养检测分化潜能和生物学活性;密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取人骨髓MSCs,分别诱导MSCs向成脂肪和成骨分化。结果表明通过免疫磁珠分离法可以获得高纯度的造血干/祖细胞,集落培养说明其具有较高的分化潜能和生物学活性;体外原代和传代培养可获得高效扩增能力的MSCs。2.重组腺相关病毒载体的获得本研究中通过磷酸钙共沉淀,三质粒共转染,肝素-琼脂糖法包装纯化含有目的基因的rAAV病毒载体;通过SDS-PAGE蛋白电泳,点杂交检测,细胞感染等检测rAAV的纯度、滴度和生物活性。结果表明包装纯化的rAAV具有较高的生物学活性,能成功感染细胞。3.筛选高效转导造血干/祖细胞的rAAV载体用rAAV1-GFP, rAAV2-GFP, rAAV6-GFP感染人造血干/祖细胞,流式检测其感染效率,结果表明rAAV1-GFP或rAAV6-GFP> rAAV2-GFP。在此结果基础上构建包装纯化获得rAAV1-β-globin和rAAV6-β-globin,用NOD/SCID裸鼠实验进一步筛选能高效转导人造血干/祖细胞的rAAV载体。经X射线照射后的NOD/SCID裸鼠,输注经rAAV-β-globin感染后的重型β-地中海贫血流产胎儿的造血干/祖细胞,移植后检测裸鼠体内人β-globin的表达。结果表明:WesternBlot检测移植后裸鼠外周血中人(3-globin蛋白,IPP软件灰度扫描分析结果为rAAV1 17.12, rAAV6 13.6。结论:本研究在体外成功地分离培养出具有高效扩增能力和分化潜能的人造血干/祖细胞和骨髓MSCs,并且通过rAAV载体有效地介导GFP在人造血干/祖细胞和MSCs中的表达,筛选出能高效转导人造血干/祖细胞的rAAV载体rAAV1和rAAV6。再通过体内实验,进一步筛选出转导效率rAAV1高于rAAV6。
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全文目录
摘要 4-6 ABSTRACT 6-11 英文缩略词表 11-12 前言 12-14 第一章 造血干/祖细胞的分离与培养 14-17 1.1 材料与方法 14-16 1.1.1 材料 14-15 1.1.2 方法 15-16 1.2 结果 16 1.2.1 造血干/祖细胞的纯度检测 16 1.2.2 造血干/祖细胞的集落培养 16 1.3 讨论 16-17 第二章 骨髓间充质干细胞的分离与培养 17-22 2.1 材料与方法 17-19 2.1.1 材料 17 2.1.2 方法 17-19 2.2 结果 19 2.2.1 MSCs的形态学观察和传代培养 19 2.2.2 MSCs的生长曲线的绘制 19 2.2.3 MSCs体外向成脂细胞诱导分化 19 2.3 讨论 19-22 第三章 重组腺相关病毒载体的获得 22-30 3.1 材料与方法 22-27 3.1.1 材料 22-23 3.1.2 方法 23-27 3.2 结果 27-28 3.2.1 病毒的包装 27 3.2.2 SDS-PAGE电泳检测病毒纯度 27 3.2.3 地高辛斑点杂交检测病毒物理滴度 27-28 3.2.4 病毒的生物活性检测 28 3.3 讨论 28-30 第四章 筛选高效转导造血干/祖细胞的rAAV载体 30-36 4.1 材料与方法 30-33 4.1.1 材料 30-31 4.1.2 方法 31-33 4.2 结果 33-34 4.2.1 流式细胞仪检测感染后人造血干/祖细胞GFP荧光强度 34 4.2.2 经照射裸鼠移植后一般状况观察 34 4.2.3 经照射裸鼠移植后血红蛋白Western Blot检测 34 4.2.4 经照射裸鼠移植后骨髓细胞集落的生成 34 4.3 讨论 34-36 结论 36-37 综述 37-40 附图 40-47 参考文献 47-52 致谢 52-53 攻读学位期间主要的研究成果 53
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 血液及淋巴系疾病 > 血液疾病 > 贫血病 > 溶血性贫血 > 先天性溶血性贫血
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