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香豆雌酚的提取分离及人群摄入量评估

作　者: 宋婉睿
导　师: 谢明勇
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学
关键词: 香豆雌酚 植物雌激素 响应曲面法 高速逆流色谱 LC-MS/MS 问卷调查 摄入量评估
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


香豆雌酚(coumestrol),一种酮类香豆素,是紫花苜蓿中主要的植物雌激素,已被现代研究证实具有雌激素样和抗雌激素作用,且对抗癌、防治骨质疏松、降血糖及调节免疫系统等有一定疗效。另外,香豆雌酚还具有缓解由β-雌二醇引起的内皮组织依赖性冠状静脉舒张和抑制SR12813对人体孕烷X受体活性的拮抗等作用。本课题以紫花苜蓿为实验材料,对其中香豆雌酚的提取、分离、纯化等方面进行研究,旨在优化香豆雌酚的提取分离条件,找到一条简单、合理、快速的提取工艺路线,为进一步研究其生理活性提供物质基础。同时,本研究对人群膳食中的香豆雌酚摄入量进行一系列的统计分析,为人群膳食的植物雌激素风险评估提供可靠依据。主要研究成果如下：1.建立了分光光度法测定紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物含量的方法,经方法学考察证实该方法具有良好的精密度、线性关系、重现性及回收率,适合紫花苜蓿中香豆雌酚粗品的简单快速测定。并以此为检测方法,研究响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺,得到香豆雌酚粗提取的最佳工艺为：在液料比27.28 mL/g,提取温度67.7℃时,采用甲醇回流提取13.77 h,此时紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率为2.64‰,与预测值2.62‰的相对误差为0.76%。2.建立了紫花苜蓿中香豆雌酚的高速逆流色谱分离方法。通过分层时间考察和分配系数测定等溶剂选择方法,得到适合用于紫花苜蓿中香豆雌酚的分离纯化的四种体系：丙酮-正己烷-乙醚-水(2:1:1:1)、(1.5:1:1:1)、(1:1:1:1)和水-N,N-二甲基甲酰胺-丙酮-四氯化碳(2:4:3:5),并对水-N,N-二甲基甲酰胺-丙酮-四氯化碳(2:4:3:5)和丙酮-正己烷-乙醚-水(1.5:1:1:1)两体系进行色谱条件优化试验,经综合比较两体系的优缺点,确定采用此两体系实现两步纯化紫花苜蓿中香豆雌酚的方法。且经纯化后的香豆雌酚样品采用紫外扫描法、液质联用(LC-MS/MS)鉴定,确定产品为香豆雌酚,纯度在97%以上。3.建立香豆雌酚的LC-MS/MS检测方法,色谱柱是Agilent XDB-C,8柱(4.6×50 mm,1.8μm),柱温是30℃,流动相为乙腈-水(55:45,V:V)等度洗脱,流速是0.35 mL/min,在质谱的多反应监测负离子模式下分析。结果表明：由于香豆雌酚在食品中的含量差别较大,在优选的色谱和质谱条件下,建立四条标准曲线Y=154.6389X+15.8700 (R2=0.991)、Y=102.3375X+134.3646 (R2=0.999)、Y=116.9685X-10809.6435 (R2=0.999)、Y=36.8953X+48246.5312 (R2= 0.995),其线性范围分别是0.4-4 ng/mL、0.8-28 ng/mL、100-600 ng/mL、500-1200 ng/mL;并通过SPSS13.0将四条线性标准曲线拟合成一条非线性标准曲线Y=225.187X3-0.233X2-385.180 (R2=0.997);其检测限为0.107ng/mL,定量限为0.357 ng/mL;经方法学考察证实该方法具有良好的精密度、线性关系、重现性及回收率,能够满足实际样品的检测要求。4.通过建立香豆雌酚的LC-MS/MS检测方法,对食品的香豆雌酚含量进行检测。并结合人群膳食调查,对人群膳食中香豆雌酚的摄入量进行统计分析。得到总体人群的香豆雌酚摄入量范围为26.282-802.468μg/日,人均摄入量为113.182μg/日,为植物雌激素的人群膳食风险评估提供有效依据。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章 绪论  11-32
  1.1 植物雌激素概述  11-12
  1.2 紫花苜蓿的概况  12-14
    1.2.1 紫花苜蓿的化学成分研究  12-14
      1.2.1.1 植物雌激素类物质  12-13
      1.2.1.2 叶蛋白  13
      1.2.1.3 膳食纤维  13
      1.2.1.4 苜蓿多糖  13-14
      1.2.1.5 苜蓿皂苷  14
    1.2.2 紫花苜蓿的药理作用  14
  1.3 香豆雌酚的研究进展  14-25
    1.3.1 香豆雌酚简介  14-15
    1.3.2 香豆雌酚的结构  15
    1.3.3 香豆雌酚的代谢  15
    1.3.4 香豆雌酚的理化性质  15-16
    1.3.5 香豆雌酚提取方法研究进展  16-17
    1.3.6 香豆雌酚的分离纯化研究进展  17-18
      1.3.6.1 溶剂萃取法  17
      1.3.6.2 层析法  17-18
      1.3.6.3 逆流分布法  18
    1.3.7 香豆雌酚的分析检测技术研究进展  18-22
      1.3.7.1 物理化学分析法  18
      1.3.7.2 紫外分光光度法  18
      1.3.7.3 荧光光度法  18-19
      1.3.7.4 HPLC法  19-20
      1.3.7.5 LC-MS/MS法  20-21
      1.3.7.6 GC-MS法  21-22
      1.3.7.7 生物鉴定法  22
    1.3.8 香豆雌酚的合成  22
    1.3.9 香豆雌酚的功能活性研究进展  22-25
      1.3.9.1 对生殖能力的影响  22-23
      1.3.9.2 抗癌  23
      1.3.9.3 防止骨质疏松症  23-24
      1.3.9.4 降血糖  24
      1.3.9.5 调节免疫系统  24
      1.3.9.6 毒理研究  24-25
  1.4 高速逆流色谱技术的研究进展  25-29
    1.4.1 高速逆流色谱技术的原理  25
    1.4.2 高速逆流色谱技术的应用  25-29
  1.5 本研究的目的意义、主要研究内容和创新性  29-32
    1.5.1 本研究的目的意义  29-30
    1.5.2 本研究主要内容  30
    1.5.3 本研究的创新性  30-32
第2章 紫花苜蓿中香豆雌酚的提取分离纯化研究  32-67
  2.1 引言  32-33
  2.2 实验部分  33-37
    2.2.1 材料与试剂  33
    2.2.2 仪器与设备  33
    2.2.3 实验方法  33-37
      2.2.3.1 响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺  33-35
      2.2.3.2 高速逆流色谱法分离纯化紫花苜蓿中的香豆雌酚  35-37
  2.3 结果与讨论  37-65
    2.3.1 响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺  37-47
      2.3.1.1 测定波长的选择  37
      2.3.1.2 紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物的测定  37-40
      2.3.1.3 提取单因素条件的考察  40-43
      2.3.1.4 响应曲面试验分析与优化  43-47
    2.3.2 高速逆流色谱法分离纯化紫花苜蓿中的香豆雌酚  47-65
      2.3.2.1 HPLC流动相条件的确定  47-48
      2.3.2.2 高速逆流分离条件的确定  48-61
      2.3.2.3 香豆雌酚制备的高速逆流色谱条件的确定  61-62
      2.3.2.4 自制香豆雌酚的鉴定  62-65
  本章小结  65-67
第3章 人群膳食中香豆雌酚的摄入量评估  67-89
  3.1 引言  67
  3.2 实验部分  67-71
    3.2.1 材料与试剂  67
    3.2.2 仪器与设备  67-68
    3.2.3 实验方法  68-71
      3.2.3.1 人群膳食摄入量调查  68-69
      3.2.3.2 食品中香豆雌酚的含量检测  69-71
      3.2.3.3 香豆雌酚的膳食摄入量计算  71
  3.3 结果与讨论  71-87
    3.3.1 人群膳食摄入量调查  71-72
      3.3.1.1 问卷回收情况  71-72
      3.3.1.2 调查问卷的分析  72
    3.3.2 食品中香豆雌酚的检测  72-84
      3.3.2.1 质谱条件的选择  72-75
      3.3.2.2 色谱条件的选择  75
      3.3.2.3 标准曲线与线性范围  75-77
      3.3.2.4 信噪比与检测限  77
      3.3.2.5 标准曲线拟合  77-80
      3.3.2.6 方法学考察  80-81
      3.3.2.7 食品中香豆雌酚的含量检测  81-84
    3.3.3 香豆雌酚的人群摄入量统计  84-87
      3.3.3.1 香豆雌酚不同人群摄入量的分布  84-86
      3.3.3.2 香豆雌酚的人群摄入量总体分布  86-87
  本章小结  87-89
第4章 结论与展望  89-92
  4.1 结论  89-90
  4.2 进一步工作的方向  90-92
致谢  92-93
参考文献  93-102
附录1 日常食物人均摄入量调查问卷  102-106
附录2 不同年龄段人群每日食物平均摄入表  106-113
附录3 样品中香豆雌酚含量表  113-119
攻读学位期间的研究成果  119

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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