学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

莱克多巴胺及磺胺二甲基嘧啶免疫学快速检测技术研究

作　者: 李学伍
导　师: 陈焕春；张改平
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 莱克多巴胺磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体药物残留快速检测试剂盒和试纸条
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 365次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

莱克多巴胺属于β-受体激动剂家族苯乙胺类成员之一,此类化合物因其具有促进和提高动物生长效率而受关注,莱克多巴胺在增加猪日增重、提高胴体瘦肉率、增加饲料转化、降低脂肪的积聚、缩短饲养周期等方面具有强大的功效。莱克多巴胺常被猪场作为饲料添加剂使用,莱克多巴胺的非法使用,导致了其在动物体内的蓄积性残留,引发人体的急性食物中毒。因此,我国及欧盟各国政府禁止进口含有Rac的肉品,并明确规定禁止使用Rac作为促生长剂。为了控制和预防猪的某些疾病、促进猪的生长,磺胺二甲基嘧啶常常被添加在猪的饲料之中,磺胺二甲基嘧啶在饲喂动物的组织中具有蓄积作用,猪组织中磺胺二甲基嘧啶的残留,对消费者而言将是一种潜在的危害,可引起过敏反应、干扰肠道菌群并诱生抗性菌群,从而导致抗生素的疗效下降。磺胺二甲基嘧啶还是一种可疑的致癌物,研究表明高浓度的磺胺二甲基嘧啶可以引起鼠的甲状腺瘤。FDA规定了磺胺二甲基嘧啶的休药期为15d,并设定了磺胺二甲基嘧啶在组织中的最高残留限量为100ng/g。近年来,磺胺二甲基嘧啶及莱克多巴胺残留已成为人们共同关注的重大问题。以GC、MS、LC技术为基础建立了检测Rac、SM2的确证方法,这些方法具有高度的敏感性,但所需仪器设备昂贵、前处理繁琐、检测费时,要完成大量样品的检测存在较大的困难,因此,目前急需简单快速、经济实惠、能够用于大批样品的检测方法。本研究旨在研发敏感特异、简单快速、能用于日常监督和检测的可靠筛选方法。在该研究中重点集中于BSA-SM2、BSA-Rac的免疫原性的研究,建立了能够高效分泌SM2、Rac单抗的杂交瘤细胞9株,并制备生产了上述单抗。设计研发了SM2、Rac残留检测试剂盒4种、快速检测试纸条2种,产品性能通过了HPLC、GC-MS的确证。主要研究内容如下:在分析Rac分子结构和免疫原性的基础上,利用化学修饰法将活性基团羧基引入Rac苯环上,应用混合酸酐法使引入的活性基团羧基与牛血清白蛋白(BSA)分子上的氨基发生反应形成酰胺键,制备BSA-Rac结合抗原,用同样的方法制备OVA-Rac。用重氮化法将SM2偶联于BSA和鸡卵清蛋白OVA,合成人工免疫原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2,通过红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE分析,证明药物与蛋白成功偶联,BSA-SM2、BSA-Rac分子结合比分别约为1:19和1:20;小鼠免疫实验证明,上述人工抗原能够诱导针对药物的特异性抗体。用BSA-SM2、BSA-Rac免疫Balb/c鼠5次,SM2、Rac抗体效价均达到了6.4×10~3,SM2半数抑制浓度(IC50)为9.51 ng/mL,Rac的IC50为7.11 ng/mL,经琼脂扩散、阻断ELISA、胶体金印迹实验鉴定,除磺胺甲基嘧啶与SM2抗体轻微交叉外,其它化合物与SM2抗体和Rac抗体均无交叉反应。以聚乙二醇(PEG1500)为融合剂,将免疫鼠脾细胞与NS0瘤细胞融合建立了杂交瘤细胞系,获得了稳定分泌抗SM2和Rac高亲和力、高敏感性抗体的杂交瘤细胞9株。SM2杂交瘤细胞株分别为SM2H10,SM2E2,SM2A10和SM2G5,细胞上清效价为3.2×10~2-6.4×10~2,腹水效价为6.4×10~4-3.2×10~5,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG1/λ,IgG1/κ,亲和常数(Ka)为3.71×10~8-2.21×10~9L/mol。Rac杂交瘤细胞株分别为RacB5,RacC3,RacE6,RacH1和RacF4,细胞上清效价为3.2×10~2-6.4×10~2,腹水效价为1.28×10~5-6.4×10~5,单抗亚型为IgG2a/κ,IgG2b/λ,IgG1/κ,IgG2a/λ,亲和常数(Ka)为5.46×10~8-3.43×10~9L/mol。研制出了SM2、Rac快速检测试剂盒A(SM2-Kit A,Rac-Kit A)和试剂盒B(SM2-Kit B,Rac-Kit B),试剂盒A的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为1.0-128.0 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL。SM2-KitA和Rac-Kit A饲料的平均添加回收率分别为89.4%、89.1%、猪尿的平均添加回收率分别为90.5%、91.8%;平均批内和批间变异系数均小于15%;SM2-KitA与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率为2.75%,Rac-Kit A与其他化合物无交叉反。不同稀释基质对SM2-KitA和Rac-Kit A的检测结果没有影响;试剂盒在4℃保存,有效期为6个月。试剂盒B稍逊于试剂盒A,实验结果证明两者均可用于SM2、Rac残留的快速检测。利用胶体金标记技术,成功研制了SM2、Rac残留快速检测试纸,两种试纸的标准检测曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合。Rac-Strip、SM2-Strip机读检测限分别为0.154 ng/mL和0.165 ng/mL,目测检测限分别为2.0 ng/mL和3.0 ng/mL,SM2-Strip与磺胺甲基嘧啶有轻微交叉反应,Rac-Strip无交叉反应,检测试纸在4℃保存,有效期为12个月。HPLC确证实验表明,SM2-strip和HPLC之间的差异为1.3%-4.3%,SM2-kit和HPLC之间的差异为2.5%-4.6%;数据统计分析证明SM2-strip及SM2-kit和HPLC检测结果无显著差异。GC-MS确证实验表明,Rac-strip和GC-MS的差异为1.0%-4.7%,Rac-kit和GC-MS的差异为1.1%-4.0%,数据统计分析证明Rac-strip、Rac-kit和GC-MS检测结果无显著差异。SM2和Rac试剂盒和试纸条,具有特异敏感、简单快速、易于操作、经济实惠的特点,试剂盒检测需时40min,试纸条检测需时10min,结果可靠,可用于定性和半定量检测。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略语表  13-15
第一章磺胺类药物残留检测研究进展  15-32
  1.1 磺胺类药物的特性  15-19
    1.1.1 磺胺类药物的理化性质  15-16
    1.1.2 磺胺类药物的分类  16
    1.1.3 磺胺类药物的药理作用机理  16-17
    1.1.4 磺胺类药物的化学结构与生物活性的关系  17-18
    1.1.5 磺胺类药物的体内代谢特点  18-19
  1.2 磺胺类药物的应用及安全评价  19-22
    1.2.1 磺胺类药物的应用  19-20
    1.2.2 磺胺类药物对机体的危害  20-21
    1.2.3 磺胺类药物对环境的危害  21-22
  1.3 磺胺类药物的残留检测及监控  22-32
    1.3.1 微生物学检测法  22-23
    1.3.2 理化检测方法  23-26
    1.3.3 免疫学检测方法  26-30
    1.3.4 兽药残留的监控  30-32
第二章莱克多巴胺残留检测研究进展  32-45
  2.1 莱克多巴胺的特性  32-38
    2.1.1 莱克多巴胺的理化性质  32-33
    2.1.2 莱克多巴胺对动物生长性能的影响  33
    2.1.3 莱克多巴胺的构效关系  33-35
    2.1.4 莱克多巴胺的作用机理  35-36
    2.1.5 莱克多巴胺对机体组织的影响  36-37
    2.1.6 莱克多巴胺体内代谢过程  37-38
  2.2 莱克多巴胺的残留、使用及安全评价  38-41
    2.2.1 莱克多巴胺的代谢残留  38-39
    2.2.2 莱克多巴胺的使用  39-40
    2.2.3 莱克多巴胺对动物和人的毒性作用  40-41
  2.3 莱克多巴胺的残留检测  41-45
    2.3.1 酶联免疫检测方法  41-42
    2.3.2 高效液相色谱法  42-43
    2.3.3 气质联用及液-质联用法  43
    2.3.4 免疫传感器法  43-44
    2.3.5 免疫金标试纸法  44-45
第三章本论文研究目的和意义  45-47
第四章 SM2和Rac人工抗原的制备及特性鉴定  47-64
  4.1 材料与方法  47-52
    4.1.1 材料  47-49
    4.1.2 方法  49-52
  4.2 结果与分析  52-60
    4.2.1 SM2和Rac人工抗原的鉴定  52-56
    4.2.2 SM2和Rac人工抗原免疫原性的鉴定  56-60
  4.3 讨论与小结  60-64
    4.3.1 关于人工完全抗原的设计  60-61
    4.3.2 关于人工完全抗原的制备方法  61-62
    4.3.3 关于人工抗原的免疫原性  62-63
    4.3.4 小结  63-64
第五章 SM2、Rac单克隆抗体的制备及其特性鉴定  64-91
  5.1 材料与方法  64-72
    5.1.1 材料  64-66
    5.1.2 方法  66-72
  5.2 结果与分析  72-87
    5.2.1 细胞融合小鼠的选择  72-78
    5.2.2 杂交瘤细胞株的建立  78-87
  5.3 讨论与小结  87-91
    5.3.1 关于小鼠免疫和血清抗体  87
    5.3.2 关于融合小鼠的选择方法及注意事项  87-88
    5.3.3 关于杂交瘤细胞株的筛选方法  88
    5.3.4 关于mAbs亲和力常数的测定方法  88-89
    5.3.5 关于抗体胶金印迹试验  89-90
    5.3.6 小结  90-91
第六章试剂盒的研制及SM2和Rac在猪尿中的排泄规律  91-122
  6.1 材料与方法  91-97
    6.1.1 材料  91-92
    6.1.2 方法  92-97
  6.2 结果与分析  97-115
    6.2.1 ELISA试剂盒A  97-105
    6.2.2 ELISA试剂盒B  105-113
    6.2.3 试剂盒A与试剂盒B性能的比较  113
    6.2.4 试剂盒测定SM2和Rac在猪尿液中的排泄规律  113-115
  6.3 讨论与小结  115-122
    6.3.1 小分子半抗原的免疫学分析  115-116
    6.3.2 小分子半抗原检测方法及原理  116-117
    6.3.3 指示系统的标记酶  117-118
    6.3.4 酶标记方法  118-119
    6.3.5 试剂盒A和试剂盒B的特点  119-120
    6.3.6 SM2和Rac的休药期  120
    6.3.7 小结  120-122
第七章 SM2和Rac快速检测试纸的研制及对样品的测定  122-144
  7.1 材料与方法  122-128
    7.1.1 材料  122-123
    7.1.2 方法  123-128
  7.2 结果与分析  128-137
    7.2.1 胶体金颗粒大小及均一性鉴定  128-129
    7.2.2 mAbs最佳标记浓度的测定  129-130
    7.2.3 检测试纸的组装  130-131
    7.2.4 试纸机读检测方法的建立  131-134
    7.2.5 半定量目测检测方法及检测极限  134
    7.2.6 检测试纸的特异性  134-135
    7.2.7 检测试纸的重复性  135-136
    7.2.8 保存期检验  136
    7.2.9 试纸对样品的检测  136-137
  7.3 讨论与小结  137-144
    7.3.1 试纸的检测原理  137-140
    7.3.2 胶体金颗粒大小与标记的关系  140-141
    7.3.3 胶体金标记技术的优势  141
    7.3.4 胶体金的制备方法  141
    7.3.5 胶体金的质量鉴定  141-142
    7.3.6 最佳标记蛋白浓度的测定  142
    7.3.7 NC膜的性能与检测结果  142
    7.3.8 检测试纸的特性  142-143
    7.3.9 小结  143-144
第八章快速检测试纸和试剂盒与确证方法的比较  144-156
  8.1 材料与方法  144-147
    8.1.1 材料  144-145
    8.1.2 方法  145-147
  8.2 结果与分析  147-152
    8.2.1 试剂盒和试纸条与确证方法参数的比较  147-148
    8.2.2 SM2试剂盒和试纸条与确证方法的比较  148
    8.2.3 Rac试剂盒和试纸条与确证方法的比较  148-149
    8.2.4 GC-MS与SM2试剂盒和试纸条对猪尿液测定结果的比较  149-150
    8.2.5 GC-MS与Rac试剂盒和试纸条对猪尿液测定结果的比较  150-152
  8.3 讨论与小结  152-156
    8.3.1 SM2和Rac残留检测方法的要求  152
    8.3.2 SM2和Rac不同检测方法敏感性的比较  152-153
    8.3.3 SM2和Rac不同检测方法所需费用和时间的比较  153-155
    8.3.4 小结  155-156
研究结论  156-158
参考文献  158-178
致谢  178-179
附录  179-180

莱克多巴胺及磺胺二甲基嘧啶免疫学快速检测技术研究

内容摘要

全文目录

相似论文